苏云金芽孢杆菌WB7几丁质酶定点突变研究

【摘要】： 几丁质是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)以β-1,4糖苷键连接而成的直链状高分子生物多聚体,是昆虫表皮、骨骼及中肠围食膜的组成成分。几丁质酶可催化降解几丁质的β-1,4糖苷键,破坏昆虫围食膜并干扰昆虫的生长发育,所以引起人们的重视。本研究通过对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)WB7菌株几丁质酶催化区的活性位点进行定点突变实验,构建了12个突变体pET-F201L、pET-F201Y、pET-G203A、pET-G203D、pET-D205E、pET-D205N、pET-D207E、pET-D207N、pET-W208C、pET-W208R,pET-E209D和pE%E209Q,从而研究酶活性中心功能基团在酶催化中的作用机制。 结果表明,突变体pET-F201L、pET-G203D、pET-D205N、pET-D207E、pET-D207N、pET-W208C和pET-E209D在各测活条件下均完全失活,而pET-F201Y的酶活力下降了72%,pET-G203A酶活力下降了70%,pET-D205E酶活力是野生型的52%,pET-W208R的酶活力是野生型的69%,pET-E209Q的酶活力是所有突变体中最高的,是野生型的71%。pH-酶活曲线表明,pET-F201Y、pET-G203A与pET-D205E作用的pH范围变窄了,与野生型相比,pET-D205E的有效pH范围缩小了一个单位,而pET-F201Y与pET-G203A则缩小了2个单位。几个仍有酶活的突变体及野生型几丁质酶作用的最适pH均为8.0。从温度-酶活曲线可以看出,突变体pET-G203A的热稳定性下降了,其作用的最适温度为50℃,当温度达到60℃时,酶活急剧下降,而野生型几丁质酶及其它突变体作用的最适温度为60℃,当温度达到70℃时,酶活迅速下降。 G203在几丁质酶催化中的作用可能是维持蛋白质的三维结构;D207可能在反应过程中离子化,其所带的负电荷通过形成一对离子对,从而使反应过程中生成的带正电荷的唑啉中间物保持稳定状态;而D205与D207可能通过氢键结合,这种氢键主要用于维持活性中心的离子化状态;W208可能通过“堆积效应”和氢键作用与底物结合,若被其它氨基酸取代后,很可能会影响到酶对底物的识别与结合,进而影响酶活;E209很可能作为一种广义酸,用于提供质子,它可能参与了催化机制中的第一环节也是最关键的一个环节,就是糖苷键的质子化作用,同时也参与了第二步,也就是作为质子受体,从水获得质子;F201作用机理目前尚不清楚。