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邻羟基苯甲酸胁迫下不同杉木优良无性系mRNA差异显示分析

徐丽然  
【摘要】: 杉木是我国南方最重要的造林树种之一,目前大多数的杉木林是在连栽地上经营起来的。长期的林业生产实验表明,杉木连栽导致地力衰退,生产力下降,而且这种生产力下降现象随着杉木连栽次数的增加越加明显。自毒作用是导致其连栽障碍的一个重要原因。 本研究以组培试验为平台,人工模拟逆境胁迫试验为手段,初选出自毒物质忍耐型、中间型和敏感型3种杉木无性系组培苗基础上,采用mRNA差异显示技术,获得差异条带,对差异条带克隆、测序,通过与GeneBank中的数据库比对分析,所得结果如下: 1.杉木组培苗各无性系在添加了自毒物质邻羟基苯甲酸(120 mg/L)的增殖培养基上培养,通过调查其毒害指数发现,自毒物质邻羟基苯甲酸对无性系FS02的抑制作用最强,无性系FS01居中,无性系FS10最小,据此把无性系FS02作为自毒物质敏感性无性系,无性系FS01作为自毒物质中间型无性系,无性系FS10作为自毒物质忍耐型无性系。 2.通过比较一条、两条和三条随机引物对PCR扩增效果的影响,结果两条随机引物效果最好。 3.采用正交方法比较不同引物、MgCl_2、TaqDNA聚合酶、dNTP浓度及不同的退火温度对DDRT-PCR反应的影响,结果显示MgCl_2浓度为2.0 mM/L,3′端引物浓度为0.4μmol/L,5′端引物1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶为1.5 U,dNTP浓度为0.20 mM/L,退火温度为44℃,为较佳的反应体系。 4.自毒物质敏感型、中间型和忍耐性杉木无性系在添加了邻羟基苯甲酸的增值培养基上分别培养1、3、5d,取其叶片进行mRNA差异显示研究,结果显示,自毒物质敏感型无性系FS02共检测到14条差异条带,而自毒物质中间型、忍耐性无性系FS01、FS10的差异条带相对较多,分别检测到31条和38条差异条带。 5.自毒物质敏感型、中间型和忍耐性杉木无性系分别获得3个差异条带的克隆,通过序列测定及生物信息学分析,发现自毒物质敏感型杉木无性系FS02序列1.1编码的氨基酸与日本柳杉叶绿体基因组DNA和云杉atpB基因编码ATP合酶β亚基部分序列有较高的同源性,可能是与耐胁迫基因相关。自毒物质中间型杉木无性系FS01序列1.4编码的氨基酸序列与陆地棉水分胁迫保护蛋白基因和LEA基因都有较高的同源性,是重要的抗逆境胁迫基因;序列1.6编码的氨基酸与落羽杉、水松等植物的叶绿体基因的部分序列有很高的同源性,可能是与胁迫相关的基因。自毒物质忍耐性杉木无性系FS10序列1.7编码的氨基酸序列与烟草、拟南芥等植物的叶绿体基因有较高的同源性,也可能是抗胁迫的基因。自毒物质敏感型杉木无性系FS02序列1.2、1.3,自毒物质中间型杉木无性系FS01序列1.5及自毒物质忍耐性杉木无性系FS10序列1.8、1.9与已知序列同源性低,可能是与杉木耐胁迫相关的新基因。


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