稻瘟病菌几丁质酶和丝氨酸蛋白酶之水稻受体研究

【摘要】： 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起水稻重要病害,是研究植物与病原微生物相互作用的重要模式生物。已知其在侵染水稻时分泌几丁质酶、丝氨酸蛋白酶,参与致病过程。前期研究表明稻瘟病菌几丁质酶和丝氨酸蛋白酶可能是稻瘟病的致病因子,然而,它们在病程中的作用机制未明,特别是如何介导寄主水稻的响应,尚无报道。本文利用酵母双杂交系统以稻瘟病菌几丁质酶、丝氨酸蛋白酶作为诱饵蛋白,从水稻中筛选受体,研究两个蛋白与候选受体的互作关系,并探讨候选受体水稻RNAi突变体在与稻瘟病菌互作过程的变化,从而进一步明确它们在抗病或致病过程中的作用。 酵母双杂交获得与稻瘟菌几丁质酶(MoChi1)互作的阳性克隆18个,与稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶(MoSP1)互作的阳性克隆12个,同时测序并对他们进行生物信息学分析,结果发现MoChi1和MoSP1筛选到了同一个受体甘露糖凝集素OsMbl1。通过GST pull-down验证了MoChi1可以与水稻甘露糖凝集素OsMbl1、金属硫蛋白OsMtl1和MoSP1与锌指蛋白OsZfp1、甘露糖凝集素OsMbl1及A11体外互作。Western bloting结果表明MoChi1与OsMbl1和OsMtl1间存在相互作用;MoSP1可以与OsZfp1、OsMbl1体外互作,但不能与A11体外互作。 本文重点研究了OsMbl1分别与MoChi1和MoSP1互作结构域。首先,生物信息学分析表明,OsMBL1含有单子叶植物甘露糖结合凝集素家族结构域,且该结构域含有三个糖结合位;与蒜、石斛、文殊兰属等其他单子叶植物甘露糖结合凝集素的序列一致性大于50%,并具有单子叶植物甘露糖结合凝集素保守酸性氨基酸的结合位点。通过构建OsMBL1不同片段缺失突变体,经GST pull-down方法来检测其与MoChi1和MoSP1的互作特性,结果表明在与几丁质酶互作的过程中他的三个结合位点G…..GXXXD、GXGXXXEDE和GX[GAVIYWF][DNEW]是相互独立的,都能各自发挥作用。然而它与丝氨酸蛋白酶互作结果却表明只有这三个位点同时存在时才能表现出活性。 本文还分析了MoSP1与OsZfp1的互作结构域。生物信息学分析表明,OsZFP1含有一个C3HC4保守结构域,C端位置有两个跨膜螺旋序列,编码α/β型、非分泌型蛋白。缺失突变和GST Pull-down分析表明,OsZfp1与丝氨酸蛋白酶的互作只需要其C3HC4结构域,其N端和C端不是它们互作所必须的。 利用实时定量PCR技术检测OsZFP1、A11和OsMBL1基因在几丁质酶和丝氨酸蛋白酶敲除突变体和野生型Guy11侵染后的水稻叶片中的表达情况,结果表明,在丝氨酸蛋白酶敲除突变体侵染后的水稻叶片中表达量与在野生型侵染后的水稻叶片中的表达量相比,OsMBL1在72小时前表现为下调,在96小时后表现为上调;OsZFP1都表现为下降;而A11基因的表达量无多大差异。OsMBL1基因在几丁质酶敲除突变体侵染后的水稻叶片中的表达量先表现为下调,48小时后达到最小,接着又有所回升。与野生型侵染后的水稻叶片中的表达量相比,在72小时前表现为下调,在96小时后表现为上调 此外,本研究还分别构建了OsMBL1和OsZFP1基因的RNAi及超表达载体并转化水稻,目前已获得OsMBL1和OsZFP1基因的RNAi植株,超表达转基因植株尚未获得。因而,两个蛋白的生物学功能还有待深入研究。