烟草花叶病毒外壳蛋白诱导烟草抗病毒作用

【摘要】： 植物诱导抗病性是在诱导因子的作用下,激活植物自身的抗病机制来抵抗病原物的侵染。抗病诱导剂的开发与利用在植物防治上开辟了一个新的领域,利用抗病诱导剂来防治植物病毒病也是植物病毒病防治的理想选择。 本研究以烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)为材料,制备了臭氧处理的TMV-CP和融合表达的TMV-CP这两种诱导剂,通过涂抹烟草,研究寄主植物的抗病反应。主要的研究结果如下: 从感染TMV的发病烟草叶片中提取病毒,提纯病毒通入6g/L臭氧灭活10分钟,再透析处理得到了臭氧处理的TMV-CP。 提取被TMV侵染的烟草叶片总RNA,扩增CP(Coat Protein)基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上,经同源性分析表明,与TMV-U1株系同源性为99%。将目的片段克隆到原核表达载体pET-29a上,并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导后超声波破碎所得融合蛋白以不可溶的形式存在。SDS-PAGE检测蛋白表达情况,表达产物与目的蛋白大小一致。用磷酸缓冲液(Phosphate buffer solution,PBS)配制融合蛋白,制备成融合表达的TMV-CP。 分别用臭氧处理的TMV-CP和融合表达的TMV-CP(10μg/mL)分别涂抹烟草,三天后再接种TMV,一周后用ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法测定表明,臭氧处理的TMV-CP诱导植株接种叶片的病毒相对浓度(OD值)是阳性对照的33.6%,融合表达的TMV-CP诱导植株接种叶片的病毒相对浓度(OD值)是阳性对照的47.5%,说明两种TMV-CP均可诱导烟草抗TMV的侵染。 通过对病毒-寄主互作中相关防御酶POD(过氧化物酶)、PPO(多酚氧化酶)、PAL(丙氨酸解氨酶)、SOD(超氧化物歧化酶)活性及叶绿素含量和MDA(丙二醛)含量的测定,结果表明臭氧处理的TMV-CP、融合表达的TMV-CP均能诱导烟草体内的防御酶活性增强,降低被TMV感染叶片中膜脂过氧化产物丙二醛的含量,以及阻止TMV感染造成的烟草叶绿素、可溶性糖和蛋白含量的降低。对POD、PPO两种酶的同工酶谱和病程相关蛋白谱的观察,结果表明,两种TMV-CP蛋白还能诱导烟草产生1条健叶和病叶所没有的同工酶谱带,而且还可诱导烟草产生1条健叶所没有且比接种叶片表达量高的病程相关蛋白谱带。说明臭氧处理的TMV-CP和融合表达的TMV-CP对寄主具有某种程度的诱导抗性,能提高寄主防御病毒侵染能力,并减轻病毒入侵对寄主细胞造成的伤害。