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青花菜(Brassica oleracea L.)游离小孢子培养技术研究

佟智慧  
【摘要】: 青花菜(Brassica oleracea L.var.italica Phenck)为十字花科芸苔属甘蓝类蔬菜,一二年生草本植物,其营养丰富、风味佳。但国内青花菜的研究起步较晚,优良品种不多。为了加速青花菜的育种进程,这就要求我们提高青花菜的育种效率。青花菜为异花授粉作物,杂种优势明显。使用常规方法,选择一个纯合自交系需要5~7年时间,应用小孢子技术在1~2年内即可获得大量纯合的二倍体植物,可缩短育种年限、提高育种效率;此外,获得的胚再生植株经过自然或人工加倍可获得双单倍体(DH)群体,便于遗传分析、构建遗传图谱、基因定位、转基因育种以及染色体工程和分子标记等基础研究。 在小孢子培养过程中,影响胚状体的诱导因素及胚再生植株的条件是小孢子应用技术的关键。因此,本试验以30份基因型青花菜品种为材料,进行游离小孢子培养,来完善青花菜游离小孢子培养技术体系。研究包括花蕾的选取、预处理方式及培养条件对小孢子培养及胚再生植株的影响。试验结果如下: 1.本研究选取了30份青花菜进行小孢子出胚率的影响试验,得出共有16份基因型的小孢子出胚,诱导率达53.33%。通过对出胚率较高的3份青花菜基因型的花器官形态特征观察,研究结果得出小孢子出胚最佳时期在单核晚期和双核期,此时青花菜的花蕾的长度在4.1~5.0 mm间。根据小孢子发育时期与花器官形态特征的关系,可以简便、迅速地选择适宜长度的花蕾进行游离小孢子试验。 2.游离小孢子产胚量达最高时,培养基的蔗糖浓度为13%,预处理热激温度和时间为32℃、24h时;热激时间超过24h后,小孢子胚产量逐渐下降。研究得出15%蔗糖培养液能较好地保持小孢子活性,添加和转换培养液可显著提高小孢子胚产量。 3.添加0.05mg·L-1 6-BA可显著增加青花菜小孢子胚产量,而NAA对提高小孢子胚状体的作用不明显。 4.添加0.05 mg·L-1的活性炭可提高青花菜小孢子的胚成活率;在没有添加活性炭的培养基中,小孢子胚产量虽高,但会逐渐变褐,胚成活率很低;若添加的活性炭浓度达到0.1 mg·L-1,会抑制小孢子胚状体的发生。 5.在添加了1.2%琼脂的培养基中获得最多胚再生植株,同时减少了玻璃苗的比例。子叶胚最适于胚再生植株的成活。 6.生根培养基以1/2MS+0.01% NAA+ 0.02% IBA的生根效果最好。处理植株有95%生根,最长根系达16cm。以优化的培养基对获得的青花菜胚状体进行培养获得再生植株。再生株在泥炭土与蛭石以2:1的混合搭配的基质中炼苗效果最好,植株成活率高达100%。 7.运用流式细胞仪的方法测定了单倍体、嵌合体和双单倍体的DNA含量。各倍性植株的DNA含量显著不同,这与形态学比较检测再生植株倍性的结果相同,流式细胞仪准确率达90%。同时研究发现青花菜具有较高的自然加倍能力,最高可达80%。


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