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朱砂根细胞组织培养及其岩白菜素含量分析

何雪娇  
【摘要】: 朱砂根是著名的药用花卉植物,其主要药用成分为岩白菜素。本试验以朱砂根的愈伤组织为材料,进行如下研究:①朱砂根愈伤组织的生长和分化的影响因素的研究;②朱砂根愈伤组织岩白菜素提取工艺的优化和岩白菜素含量HPLC测定方法的建立;③朱砂根悬浮细胞培养体系的建立及其细胞培养过程中的动力学研究;④朱砂根悬浮培养细胞的生长与岩白菜素含量的关系研究。主要研究结果如下: 1朱砂根愈伤组织生长与分化的研究 试验比较了不同培养基类型、不同碳源及其浓度、不同氮源、植物生长调节剂、不同光照强度、不同光质及添加物水杨酸对朱砂根愈伤组织继代、增殖与保持的影响。结果表明:MS+0.5 mg·L-1 2,4-D是朱砂根愈伤组织继代、增殖与保持的最佳培养基;最佳碳源为25 g·L-1蔗糖;最佳氮源为1900 g·L-1 KNO3;最佳培养条件为遮光培养;水杨酸的最佳添加浓度为10-5 mg·L-1,最佳添加时间为第20 d。 在MS+0.05 mg·L-1 2,4-D+2.0 mg·L-1 KT+100 mg·L-1肌醇+4 %蔗糖+3 %甘露醇+5 %椰汁培养基中根分化率最高,历时也较长;在同等条件下,激素对朱砂根愈伤组织分化根的影响效果为KT6-BANAA;1/2 MS培养基比MS培养基更易促进朱砂根愈伤组织中根的分化。 2朱砂根愈伤组织中岩白菜素的提取工艺、测定及含量研究 本试验在单因素试验的基础上选取提取温度、提取时间、水料比这3个因素进行二次回归正交组合设计试验(响应面分析法),利用响应面法对其提取工艺参数进行优化研究。结果表明,当提取时间为49.7411 min,提取温度为80.0846℃,料液比为1:9.9966时,岩白菜素浓度达到最大为81.3388 ug·mL-1。 测定方法:HPLC的流动相为甲醇:水=20:80(梯度洗脱),检测波长为275 nm。 试验比较了不同培养基类型、不同碳源、不同氮源、植物生长调节剂、不同光照强度、不同光质及添加物水杨酸对朱砂根愈伤组织中岩白菜素含量的影响。结果表明:有利于朱砂根愈伤组织中岩白菜素含量的积累的培养基为4 mg·L-1 2,4-D + 1.5 mg·L-1 NAA + 0.5 mg·L-1 KT;0.5 g·L-1水解酪蛋白可以提高岩白菜素的含量;最佳氮源为1650 mg·L-1 NH4NO3;最佳光照为遮光培养;绿光可提高岩白菜素的含量;培养第20 d添加10-4 mg·L-1水杨酸可提高岩白菜素的含量。 3朱砂根悬浮细胞系的建立及培养过程中的动力学研究 本试验将颗粒性强的的愈伤组织进行悬浮培养,研究了基本培养基、激素、培养条件、接种量,细胞浓度及碳源对朱砂根细胞培养中细胞生长和岩白菜素含量的影响;测定了朱砂根细胞生长和岩白菜素积累的动态变化,并对悬浮培养的理化特性和动力学做了初步的研究。结果表明:悬浮培养细胞在MS培养基中生长良好,细胞分散性较好;最佳激素组合为0.5 mg·L-1 2,4-D+0.05 mg·L-1KT +0.1 mg·L-1 NAA;细胞继代周期以8 d左右为宜;悬浮细胞适合在23℃-25℃、110 rpm下生长;最佳碳源为蔗糖15 g·L-1添加0.03 g·L-1Ad;最佳接种密度为0.0714 g·mL-1。 悬浮培养细胞在第3-7 d为对数生长期,细胞干重至第7 d达到最大。在细胞对数生长期内,岩白菜素积累与细胞生长呈线形正相关性,第7 d岩白菜素含量达到最大值0.0148 %。朱砂根悬浮培养基中营养物质(如氮源、磷源和碳源)的消耗与生物量的积累和岩白菜素的生物合成呈一定的相关性。 试验建立了朱砂根细胞生长、蔗糖消耗、岩白菜素合成的动力学方程:细胞生长:底物消耗产物合成: 上式中,μ代表比生长速率,μm代表最大比生长速率,KS代表底物饱和常数,KI代表底物抑制常数,Cs代表底物浓度,qs代表底物的比消耗速率,YX/S代表为底物消耗对细胞的得率系数,m代表细胞的维持系数,YP/S代表产物对底物消耗的得率系数,qp代表产物的比生产速率,α,β代表比例系数。 经过验证,模型预测值与试验结果有较高的拟合度,说明模型具有一定的合理性、可信度。 4朱砂根悬浮细胞生长与岩白菜素含量关系研究 在MS基本培养基中,60 mM的硝态氮而去掉氨态氮,朱砂根悬浮培养细胞的生长最快;而当氨态氮与硝态氮的摩尔浓度比为5:1,总氮源为40 mM时,悬浮培养细胞岩白菜素的生物合成能力最强。采用氮源改变调节的二步培养可使细胞的生物量和岩白菜素含量分别达到0.3498 g和0.0478 %,分别为对照的3.11倍和3.57倍。 磷酸盐浓度为1.1 mM时,即为MS基本培养基中磷酸盐浓度时,细胞生长量达到最高为0.1851 g,岩白菜素的含量也达到最大为0.0239 %;Mn2+,Zn2+,BO33+,I-,MoO42-,Cu2+,Co2+,Fe2+这8种元素中I-,MoO42-,Cu2+,Co2+对岩白菜素的合成影响较大,I-浓度提升到5倍,MoO42-浓度提升10倍,Cu2+浓度提升10倍,Co2+浓度提升20倍,即I-(25μM),MoO42-(10μM),Cu2+(1μM),Co2+(2μM)时对岩白菜素合成效果最佳。在这四种微量元素的最佳浓度的协同作用下,朱砂根细胞的生长量和岩白菜素的含量可分别达到0.2105 g、0.0287 %,分别是对照的168.43 %、227.78 % 添加诱导子水杨酸10-5 mg·L-1,且在第6 d加入时,岩白菜素含量达到最大。


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