荔枝霜疫霉菌生物学特性及其遗传转化体系的建立

【摘要】：本文对荔枝霜疫霉菌的生物学特性及其原生质体遗传转化体系进行了较为系统地探讨。研究表明,荔枝霜疫霉菌的孢囊梗属于多级有限生长,其孢子囊可以萌发成芽管、游动孢子和次生孢子囊,该菌培养35d后可产生内生厚垣孢子;同时明确了荔枝霜疫霉菌生长及产孢的最佳条件,菌丝生长最适的条件为:pH 7.0的利马豆培养基,温度为24℃,光照20 h;产孢最适条件为:pH 7.0的PDA培养基,温度为24℃,光照16 h;另外还明确了该菌孢子囊的致死温度为:55℃、10min。当霜疫霉菌在菌龄为11d,温度为24℃,pH值为7时产生的孢子囊萌发率最高。实验还表明,荔枝霜疫霉菌在不同的温度条件、培养时间、pH值和营养成分下其萌发状态和萌发率不同。 本研究优化了霜疫霉菌原生质体制备与再生条件,明确了该菌原生质体形成与再生的最佳条件为:PDA培养基,酶为15mg·mL-1崩溃酶,酶解时间为4h,酶解温度为30℃,菌龄为4d,再生培养基是以0.6M甘露醇为渗透压稳定剂的利马豆培养基。最终得到原生质体产量为107个·mL-1,再生率为0.1%。 本研究还建立了荔枝霜疫霉菌的原生质体遗传转化体系,构建了1个GFP表达载体。并成功地将pHAMT35G-gfp表达载体和pTH209选择标记质粒转化到霜疫霉菌原生质体中,得到转化子。经过选择性平板筛选、PCR扩增目的片段验证,确认nptⅡ和GFP基因己经插入霜疫霉菌基因组中。