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荔枝采后主要病原菌的特性及内生细菌对其防治保鲜研究

蔡学清  
【摘要】:荔枝是中国南方的亚热带名果,也是最不耐贮藏的果品之一。病原菌的侵染及果实变褐是影响其贮藏期的主要原因。目前对于该病主要是利用化学药剂来防治,而化学防治存在农药残留、污染环境等缺点,因此,生物防治成为该病防治研究的热点。另外,由于卵菌二倍体的营养生长特性,采用基因敲除等传统的基因突变方法在卵菌的基因功能研究中成功率很低,因此研究卵菌基因功能的主要方法是转化内源基因引起该基因的沉默,目前荔枝霜疫霉缺少高效的分子遗传操作技术,因此在分子水平上的研究进展缓慢,为此,本文就引起荔枝褐变腐烂的主要病原菌的生物学特性、遗传转化体系及内生细菌对其防治和保鲜作用进行较为系统的研究,主要结果如下。 荔枝霜疫霉的生物学特性。该病菌的孢囊梗属于多级有限生长,其孢子囊萌发后形成多种真菌形态,如游动孢子、芽管、孢囊梗及次生孢子囊;其芽孔位于孢子囊一端、两端或四周,在一个芽孔处可萌发一根、两根或多根芽管,位于基部的芽孔萌发能力较强。该菌培养35d后可产生厚垣孢子,培养45 d可产生大量的卵孢子,培养10 d时产生的孢子囊的萌发率最高。孢子囊在温度为16 ~ 24℃时萌发形成游动孢子,在26℃以上萌发形成芽管。该菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上的产孢量最高,在利马豆培养基(LBA)上的生长速度最快。生长的最适pH值为6 ~ 8;同时,系统的探讨了环境因子对该病菌的生长速度、产孢量、孢子囊萌发及侵染的影响。结果表明,该菌生长及产孢最适的温度为24℃,pH值为7.0;菌丝生长和产孢最适的光照时间分别为20 h和16 h;该菌孢子囊的致死温度为45℃,10 min。另外,不同的温度条件、光照时间、pH值和营养成分对其萌发状态和萌发率的影响不同。该菌在pH值为7,光照时间为20 h的PDA培养基上培养所产生的孢子囊,在24℃条件下萌发率最高。此外,该菌在24 ~ 28℃条件下最易侵染荔枝果实,其发病最为严重;超微形态研究表明,该菌可通过孢子囊及游动孢子从荔枝果皮的嵴点裂缝处与皮孔处侵入,并在果皮内扩展,直到荔枝的内果皮。通过人工接种实验表明,该菌除了侵染荔枝外,还可侵染水蜜桃。 荔枝酸腐菌的生物学特性。该菌最适宜生长与产孢的培养基为PDA培养基,而在米糠培养基生长速度最慢,其产孢量也最少;生长与产孢最适的温度为20 ~ 28℃,最适的pH范围为6 ~ 9;最适的光照时间为12 ~ 20 h;其分生孢子的致死温度为65℃, 10 min;对于该菌萌发影响条件测定表明,该菌最适宜萌发的温度为24 ~ 32℃,光照时间为20h;另外,对于该菌侵染条件研究表明,该菌最适宜侵染的温度为28 ~ 32℃;同时,通过人工接种实验表明,该菌除了侵染荔枝外,还可侵染胡萝卜、葡萄、番茄、茄子、黄瓜、龙眼果实等。 荔枝霜疫霉遗传转化体系的构建。荔枝霜疫霉的原生质体制备试验结果表明,该菌最适的酶解种类为崩溃酶,其最佳的酶解温度为24 ~ 30℃,酶解时间为4 h,菌龄为4 d;原生质体再生最佳的培养基为利马豆培养基,最佳的渗透压种类为甘露醇,其浓度为0.6mol·L-1;再生菌株在利马豆培养基上菌落形态呈白色、圆形、毛毡状,其生长速率、致病性均与亲本菌株保持一致;同时成功的将GFP基因转入荔枝霜疫霉中,获得转化子,通过PCR检测证明GFP基因已整合到病菌的DNA中,但是在荧光显微镜下观察不到荧光。 荔枝酸腐菌遗传转化体系的构建。荔枝酸腐菌的原生质体制备实验结果表明,该菌最适的酶解种类为崩溃酶,其最佳的酶解温度为30℃,酶解时间为4h,菌龄为1 d;原生质体再生最佳的培养基为YEPD培养基,最佳的渗透压种类为蔗糖,其浓度为20%;再生菌株在YEPD培养基上菌落为白色,形态呈圆形、表面粉状,其生长速率、致病性均与亲本菌株保持一致;同时成功的将GFP基因转入荔枝酸腐菌中,获得转化子,通过PCR检测证明GFP基因已整合到该菌的DNA中,并且在荧光显微镜下观察到发绿色荧光菌丝和分生孢子。 荔枝采后病原菌内生拮抗细菌的筛选。采用菌丝生长抑制法和孢子囊萌发抑制法筛选对荔枝霜疫霉、酸腐菌等荔枝采后病原菌具有抑制作用的内生生防菌。试验结果表明,从210株菌株中共筛选出155株对荔枝霜疫霉等荔枝采后病原菌具有不同抑制效果的菌株,占总菌株数的73.81%,其中抑菌带宽度10 mm的菌株有9株,占总株数的5.81%;经过反复筛选,内生枯草芽孢杆菌BS-(2Bacillus subtilis),内生解淀粉链芽孢杆菌TB2(B. amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌TL2菌株(B. subtilis)对荔枝采后病原菌的抑制作用较好,同时还具有延缓荔枝果皮褐变速度的作用。 内生细菌在荔枝体内的定殖动态和定殖位置研究。对抑制效果较好的2株内生细菌TB2和BS-2菌株,通过GFP基因标记并采用喷雾接种法研究其在荔枝体内的定殖动态和定殖部位,试验结果表明,这2株菌株均能进入荔枝叶片、花、幼果及采后果实的果皮内定殖,并能从花向幼果传导。研究发现,这2株细菌菌株在荔枝叶片上的定殖数量与定殖的时间因季节及荔枝生长周期的不同而不同,在荔枝叶片体内春季定殖时间明显比秋季长,定殖量也比秋季大。另外,这2株细菌菌株在荔枝不同组织器官中的定殖的时间与定殖量也不同,其中,在荔枝叶片定殖的时间最长,而在花上定殖的时间最短,定殖量也最少;定殖位置实验结果表明内生细菌可定殖于叶片的表皮细胞、栅栏组织、内表皮细胞以及荔枝果皮的栅栏组织、表皮细胞及内果皮。另外,在进行内生细菌定殖与防病保鲜实验时表明,内生细菌在荔枝果皮的定殖部位与定殖量与其防病保鲜效果存在一定的正相关。 内生细菌对荔枝采后病害的防治研究。防病作用研究表明,BS-2和TB2菌株对不同品种荔枝的霜霉病和酸腐病具有显著的预防效果,提前24h以上接种细菌培养液的防病效果比接种细菌培养液后立即接种病原菌的防病效果好。菌株对荔枝霜疫霉和酸腐菌的防治效果分别为:61% ~ 96.01%、33.73% ~ 90.86%。菌株通过分泌抗菌物质抑制病原菌生长、孢子囊(分生孢子)的产生与萌发,诱导植物防御性酶(如POD、SOD、CAT、PAL、几丁质酶、β-1-3-葡聚糖酶等)的活性反应,减少植物体内活性氧及丙二醛等物质的产生等,可能是菌株防病作用的主要机制。 内生细菌对荔枝采后果实的保鲜研究。保鲜作用研究表明,BS-2和TB2菌株能够明显的延缓不同品种的荔枝采后果实的褐变速度。经内生细菌处理的荔枝果实的好果率较清水处理的高246.81% ~ 248.89%(东刘1号)和38.35%(元红);另外,内生细菌菌株可以促使荔枝果皮SOD、CAT活性升高,提高了清除氧自由基的能力,以适应不良环境;而降低荔枝果皮的MDA含量以及超氧阴离子自由基的产生速率,同时还降低荔枝果皮的PPO、POD及花色素苷酶活性等,以达到降低荔枝果皮酚类物质及减缓荔枝果皮花色素苷的降解,从而在一定程度上延缓荔枝果皮的褐变速度,这可能是菌株保鲜作用的主要机制;另外,本实验对内生细菌在荔枝的保鲜过程中对荔枝果肉营养物质的影响进行初步探讨,实验结果表明,经内生细菌处理的荔枝果实的可溶性糖含量、游离有机酸含量,还原性Vc含量均较清水对照的高,处理后7 d其其果肉的氨基总量与刚采摘时的氨基酸总量相同或略低。


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