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苏云金芽孢杆菌010菌株chi36基因克隆、表达和活性测定

谢宇飞  
【摘要】: 以苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)010菌株总DNA为模板,通过PCR方法扩增几丁质酶chi36基因,将PCR回收产物与pMD18-T载体连接,构建克隆重组菌pMD-chi36,经核苷酸及氨基酸序列分析,chi36基因ORF 1083 bp,编码360个氨基酸,预测其蛋白分子量约为39.0 kDa,等电点为6.52。通过在线软件分析比对表明其核苷酸序列与Bt 15A3、Bc CH、Bc 28-9以及Bc 6E1的几丁质酶基因同源性分别为97%、99%、99%、93%。在线ScanProsite软件分析表明该几丁质酶属于18家族几丁质酶,在线软件推导出其属于一种胞外酶,蛋白质一级结构只含有几丁质酶催化区,缺少粘蛋白Ⅲ型同源区(fibronectin-like domains,FLDs)和几丁质结合区(chitin-binding domain,CBD)。 将pMD-chi36与pGEX-KG表达载体连接,构建重组表达载体pGEX-chi36,并成功转入大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)。SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白为65 kDa左右,其中包含26 kDa GST标签。提取pGEX-chi36的粗酶液,研究表明该酶对几丁质平板有降解作用。用DNS方法测定酶的活性,最适作用温度55℃,酶活为488.21 U?mL ,最适pH值5.0,酶活为170.43 U?mL。


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