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菠萝蛋白酶的分离纯化及部分应用性质的研究

董瑞兰  
【摘要】: 为满足医药领域对高活性高纯度菠萝蛋白酶的大力需求,更进一步了解菠萝蛋白酶应用的有关性质,本试验以菠萝下脚料菠萝皮为试验原料,对菠萝蛋白酶的分离纯化、性质、结构、活性的应用等方面进行了初步研究,主要内容如下: (1)利用硫酸铵分级沉淀结合CM Sepharose FF阳离子交换柱层析的方法对皮汁中所含的菠萝蛋白酶进行分离提纯,以获得试验所需材料。对提取的菠萝蛋白酶进行研究结果表明,运用此法分离纯化效果比较理想,洗脱峰上出现一个主峰,酶活性峰位于峰肩部位,纯化过程中该离子交换柱层析纯化效果较为显著,能去除色素,使纯度提高35.1倍,经纯化后菠萝蛋白酶的比活达9400U/mg,活力回收率为48.7%。 (2)对菠萝蛋白酶的部分性质进行研究结果表明,皮汁中菠萝蛋白酶相对分子质量为28800Da,纯酶液在280nm处有明显的特征吸收峰。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示单一条带,表明其纯度已达到电泳纯。通过测定温度对菠萝蛋白酶酶活的影响可知,菠萝蛋白酶的最适温度为55~65℃,在60℃时活性最高。此酶在pH 7.5近中性环境中,酶活性最高。处于偏酸性(pH7.0)环境中,酶反应速度下降快;在偏碱性(pH7.5)的环境中,菠萝蛋白酶活性逐渐下降。通过测定金属离子对酶活的影响可知,二价铁离子对菠萝蛋白酶有明显的激活作用,锌离子和铜离子的作用次之,在浓度较低时对菠萝蛋白酶表现一定的激活作用,分别比对照提高了31.9%、18.2%,但当浓度较大时反而起抑制作用。增加NaCl对菠萝蛋白酶也能起到一定的保护作用、KCl对酶反应影响不大,而MgSO4·7H2O和无水CaCl2对菠萝蛋白酶活性均有一定程度的抑制作用。在模拟猪胃条件下pH2.5胃蛋白酶对菠萝蛋白酶影响较大,37℃保温处理2h、3h后,菠萝蛋白酶的活性损失分别为49.2%、61.9%。经IR图谱分析显示此酶具有蛋白质的特征吸收峰,但结构基团与Sigma公司的茎酶标准品比较稍有不同。 (3)在K88阳性产肠毒素大肠杆菌对小肠上皮细胞的黏附试验中,感染组1的黏附率最低,作用效果最好。空白对照组中大肠杆菌对小肠上皮细胞的黏附率在相互作用的前三个小时内平均达90.6%,经菠萝蛋白酶处理的小肠上皮细胞再加K88+ETEC大肠杆菌感染时,在培养的前两个小时未见有黏附,在第3h待菠萝蛋白酶的活性有所降低时,有1.85%的黏附率。在感染组2中,大肠杆菌细胞壁经菠萝蛋白酶水解作用后,其黏附小肠上皮细胞的能力在1h、2h、3h内较空白对照分别降低31.79%、59.62%、68.15%。由此可知,菠萝蛋白酶在其活性范围内可以抑制K88+ ETEC大肠杆菌对小肠上皮细胞的黏附。


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