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三尖杉组织培养机理及种质保存研究

徐芬  
【摘要】: 三尖杉(Cephalataxus fortunei Hook.f.)是古老的孑遗植物,属常绿乔木,为我国特有树种,可用于用材、工业、观赏、抗癌。由于自然、人为等原因导致三尖杉自然资源匮乏,如何解决三尖杉资源短缺的问题成为其开发利用的关键。利用植物组织培养途径建立三尖杉苗木快速繁殖的技术是一个非常有潜力的解决方法。本试验通过对三尖杉组培苗芽诱导机理、继代增殖机理、生根机理、愈伤组织诱导机理进行探讨,研究内源激素与芽诱导率、继代增殖系数、生根率、愈伤组织诱导率之间的关系,以及研究继代代数对增殖率的影响。另外将微扦插与组织培养相结合,简化组培程序,降低组培苗的成本。本研究在前人研究工作的基础上加以改进和完善,建立三尖杉离体培养体系,为三尖杉组培工厂化提供技术支撑。主要研究结果如下: (1)三尖杉接种最好的消毒剂组合为75%酒精消毒lmin,0.1%HgCl2消毒9min,2%NaClO消毒5min,此时污染率最低,褐化率也最低,成活率最高。复合消毒剂的效果比单一消毒剂的效果好。茎段采集后立即消毒效果最好,预处理不能改善茎段的消毒效果。室内种植的三尖杉茎段消毒较容易。新萌发的幼苗茎段消毒较容易,存活率高。在各季节中,春季的茎段消毒最容易。采集于晴天的茎段污染率低于雨天的茎段污染率。 (2)芽的诱导时以WPM+IBA2.0mg·L-1+6-BA3.0mg·L-1+CM100mg·L-1为培养基诱导出来的芽体诱导率最高,芽体个数也最多,诱导率达4.22。以SH+IBA0.5mg·L-1+6-BA3.0mg·L-1所诱导出来的芽长势最好,诱导率亦达3.85。各个因素的最有利组合为:WPM+IBA0.5 mg·L-1+6-BA3.0 mg·L-1+CM100mg·L-1.各个成分中因素的主次关系为基本培养基IBA6-BA天然添加剂。WPM与DCR均适合作为三尖杉组织培养的基本培养基。添加有机添加物对芽诱导的效果不明显。加入IBA和6-BA有利于内源IAA和ZT含量的提高,而内源ABA和GA3含量下降,ABA和GA3之间呈略微反相关性。GA3含量偏高时芽体生长较慢。 (3)在芽的增殖中WPM+6-BA3.0mg·L-1+NAA0.3mg·L-1, WPM+6-BA2.0mg·L-1+IBA0.3mg·L-1这两个组合的增殖率最高,达到4.2和4.3。不同培养基配方对外植体的增殖有极显著影响。加入NAA、IBA和6-BA有利于内源IAA和ZT含量的提高,ABA和GA3之间有略微的拮抗作用。GA3含量偏高的芽体生长较慢。初步断定ZT/IAA=4.4-4.6间为佳。另外增殖系数随着继代代数的增加而增加,到第6代的时候增殖系数达到最大,可达12,第6代后随着代数的增加,增殖系数逐渐降低。 (4)在壮苗培养时,WPM+IBA 0.1mg·L-1+GA3 0.1mg·L-1组合效果最好,初步断定ZT/IAA的值为4左右生长较好,GA3含量高的明显生长较好。 (5)在生根培养中,对生根率的影响的主次关系为:IBA蔗糖NAA基本培养基。1/2 WPM+IBA1.0mg·L-1+NAAO.1 mg·L-1蔗糖10g·L-1时诱导率达73.3%。在使用生根粉处理中1/2WPM+ABT1 5.0mg·L-1组合生根率最高,达80%,且植株长势良好。生根过程中,ZT/IAA的值产生明显变化,都小于1,初步断定当ZT/IAA的值在0.25-0.45之间最为合适。此时ABA含量增加,GA3含量下降。 (6)在微扦插中,经过处理的三尖杉枝段最早在第30d开始生根,较之三尖杉其他方法的扦插生根时间提前近一个月。不同溶液的处理对三尖杉生根起决定性作用。试验结果显示选择当年生不带顶芽插条以WPM+ABT15mg·L-1稀释100倍培养液在扦插基质为细沙的条件下生根率达到最佳,生根率达85%。 (7)在愈伤组织培养中,MS+NAA.3.0mg·L-1+6-BA0.1 mg·L-1组合取得的效果最好,愈伤组织启动时间最短,平均8.3d,分化率也最高,达93.3%,培养出来的愈伤组织生长快,愈伤组织团增加明显。相较于培养前的内源激素愈伤组织中ZT含量升高,加NAA、2,4-D、6-BA有利于内源激素ZT和IAA含量的提高,而同时也导致了GA3含量的下降。愈伤组织继代4-5代为最适宜的代数,超过5代时愈伤组织生长呈现衰退现象。 (8)在愈伤组织超低温保存中,各因素最有利组合为:在糖浓度为1.2mol·L-1的条件下预培养,加入15%的二甲亚砜、0.1mol·L-1的山梨醇、5%的聚乙二醇、10%蔗糖、20%甘油为防冻剂,再经过缓冻、慢解程序。防冻剂成分中山梨醇对三尖杉愈伤组织超低温保存有显著影响,0.1mol·L-1的山梨醇作为防冻剂的成分之一对三尖杉愈伤组织超低温保存效果较好。


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