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番木瓜果实成熟期若干基因的克隆与表达分析

李荣荣  
【摘要】: 番木瓜是一种呼吸跃变型果实,采后寿命较短,研究其成熟的机理及调控机制具有重要的理论和实践意义。通过cDNA-AFLP技术分离并分析在成熟过程中差异表达的基因是目前进行成熟机理研究的一个重要手段。本研究在cDNA-AFLP分离出番木瓜果实成熟差异表达基因的基础上,选取其中与植物的生长发育相关的的cDNA片段,进行全长序列的克隆,利用RACE技术克隆了番木瓜WD-repeat蛋白基因和锌指蛋白基因全长序列。并利用半定量RT-PCR的方法,研究了这些基因在番木瓜果实成熟不同阶段的表达情况。结果表明,两个基因在果实的四个时期均有表达,且表达量随着果实的成熟发生相应的变化,表明其与番木瓜果实成熟的进程有关。本研究的主要结果如下: 1番木瓜果实WD-repeat蛋白基因的克隆与分析 利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了WD-repeat蛋白基因。其全长cDNA为1091bp,含有一个780bp的开放阅读框,编码259个氨基酸,5′端有41bp非编码区,3′端有271bp非编码区,预测相对分子量为28.66KD,等电点为7.57。根据cDNA全长推导氨基酸序列并与毛果杨、蒺藜苜蓿、葡萄等高等植物的WD-repeat蛋白基因的氨基酸序列进行同源性比对,发现同源性在70%以上,这说明WD-repeat蛋白基因在植物中有较高的保守性。并构建了来自不同物种WD-repeat蛋白基因的系统进化树,结果显示番木瓜WD-repeat蛋白基因与葡萄表现出最小的进化距离,这表明它们之间的亲缘关系最近。 2番木瓜果实锌指蛋白基因的克隆与分析 采用cDNA末端快速扩增方法,获得了番木瓜果实锌指蛋白基因的全长序列。其全长序cDNA为1378bp,含有一个1023bp的开放阅读框,编码340个氨基酸。5′端有41bp非编码区,3′端有271bp非编码区,预测相对分子量为36.95KD,等电点为4.79。根据cDNA全长推导氨基酸序列与拟南芥、葡萄、毛果杨等高等植物锌指蛋白基因的氨基酸序列进行同源性对比分析并构建系统进化树,结果显示同源性在51%以上,番木瓜与葡萄表现出最小的进化距离,这表明它们间的亲缘关系最近。 3半定量RT-PCR分析 以Actin基因为内参基因,利用半定量RT-PCR技术对WD-repeat蛋白基因和锌指蛋白基因在番木瓜绿色期、半黄期、全黄期、腐熟期四个不成熟期的表达量进行分析。结果表明,WD-repeat蛋白基因和锌指蛋白基因在番木瓜的四个不同成熟期均有表达,且随着番木瓜成熟表达量逐渐增加,而在发育后期又开始下降,且这两个基因在果实不同成熟期表达量的变化趋势一致;这说明这两个基因与番木瓜的成熟有一定的相关性,且这两个基因可能存在一定的协同作用。


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