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鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的制备及其对口蹄疫疫苗的佐剂作用

陈志华  
【摘要】: 目的: 1.克隆沙门氏菌鞭毛蛋白flic基因及其突变体flic-m并在大肠杆菌中表达,获得纯化鞭毛蛋白; 2.确认对所得纯化的鞭毛蛋白具有生物活性; 3.检验所得纯化的有活性的鞭毛蛋白FliC对O型口蹄疫疫苗的免疫佐剂作用。 方法: 1.用已有的鼠伤寒沙门氏菌基因flic进行PCR扩增,将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建克隆质粒pMD18-flic及pMD18-flic-m; 2.克隆质粒和pET-his载体双酶切,将得到的纯化基因flic及flic-m亚克隆至pET-his内,构建重组质粒pET-his-flic及pET-his-flic-m; 3.酶切、测序鉴定后,分别将重组质粒转染大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,菌体蛋白超声后的上清用AKTA Explorer蛋白纯化系统纯化; 4.鲎试剂去内毒素后,利用293-mTLR5细胞体外活性检测表明该融合蛋白的生物学活性; 5.将所提鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白用于小鼠模型试验。 结果: 1.成功扩增了flic基因及其突变体flic-m,经鉴定,原核表达载体pET-his-flic及pET-his-flic-m构建成功,插入片段测序正确; 2.将所得蛋白SDS-PAGE分析发现于与目的蛋白一致的外源蛋白带; 3.所得纯化的鞭毛蛋白具有生物活性,能刺激TLR-5通路,引起NF-κB的活化; 4.通过细胞增殖实验,间接ELISA法检测血清IgG抗体及其亚类和Real Time-PCR法测细胞因子发现所得融合蛋白对O型口蹄疫疫苗有佐剂作用。 结论: 1.利用已有的鼠伤寒沙门氏菌基因flic,通过克隆,原核表达,分离纯化得到融合蛋白FliC和FliC-m; 2.融合蛋白FliC具有良好的生物活性,而突变体蛋白FliC-m基本上表现为无生物活性。 3.所得纯化融合蛋白对O型口蹄疫疫苗有佐剂作用,且同时诱导Th1型和Th2型免疫应答反应。


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