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抗T-2毒素单链抗体的制备及该毒素对细胞毒性影响的初步研究

张薇  
【摘要】: T-2毒素是由多种真菌产生的单端孢霉烯族(trichothecenes,TS)毒素中最毒的毒素之一。该毒素在自然界中分布极为广泛,是危险的食品污染物,对人畜健康危害十分严重。为此,在本研究中,我们构建了抗T-2毒素的噬菌体单链抗体库,从中筛选亲和力较高的单链抗体,从而为T-2毒素的检测奠定基础。此外,并对其引起的细胞毒性进行了研究。 根据T-2毒素是小分子半抗原的特性,我们首先将T-2毒素与牛血清白蛋白BSA通过琥珀酸酐法进行交联使之变成完全抗原。然后用交联物T-2HS-BSA免疫Balb/c雌性小鼠。达到一定的效价后,从小鼠的脾脏中提取总RNA,反转录得到cDNA第一链,通过PCR扩增得到重链和轻链可变区VH、VL基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)组装成scFv并克隆到噬菌体载体pCANTAB5E中,构建噬菌体抗体库。通过噬菌体展示技术经过四轮淘选得到一株有亲和力的单链抗体T1。 为研究T-2毒素对骨髓瘤细胞SP2/0的毒性,我们通过显微镜观察细胞形态的变化,MTT法检测其对骨髓瘤细胞增殖抑制用,流式细胞仪检测细胞的周期,实时荧光定量PCR检测Caspase-3基因的表达情况。结果表明,T-2毒素使骨髓瘤细胞凋亡,且呈时间和剂量依赖关系。实时定量PCR表明T-2使Caspase-3基因mRNA表达发生上调。这些结果表明,Caspase-3可能在T-2毒素诱导的SP2/0细胞凋亡信号通路中起重要作用。


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