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微囊藻毒素LR致大鼠卵巢颗粒细胞氧化损伤及机制探讨

杨涛  
【摘要】:目的: 体外培养原代大鼠卵巢颗粒细胞,观察微囊藻毒素LR致大鼠卵巢颗粒细胞氧化损伤对卵巢颗粒细胞增殖、激素分泌、DNA损伤、凋亡及凋亡相关基因Bax、Bcl-2的影响,并探讨微囊藻毒素LR致大鼠卵巢颗粒细胞氧化损伤及其作用机制。 方法: 1.无菌条件下分离提取21-25日龄雌性Wistar大鼠卵巢颗粒细胞,绘制细胞生长曲线。取对数生长期细胞,以0、10、20、30μg/mlMC-LR染毒卵巢颗粒细胞,MTT法分别检测染毒24h、48h、72h的细胞增殖情况,建立大鼠原代卵巢颗粒细胞MC-LR染毒模型。 2.以0、10、20、30μg/mlMC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h,荧光法测定细胞内活性氧(ROS)水平、比色法测定细胞培养液中超氧化物岐化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。 3.染毒条件同前,MTT法检测大鼠卵巢颗粒细胞增殖情况,电化学发光法测定细胞培养液中雌二醇(E2)和孕酮(P)含量。 4.染毒条件同前,单细胞凝胶电泳检测大鼠卵巢颗粒细胞DNA损伤情况。 5.染毒条件同前,TUNEL细胞凋亡检测法检测大鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况。 6.染毒条件同前,实时荧光定量PCR测定大鼠卵巢颗粒细胞Bax和Bcl-2基因mRNA的表达量变化。 结果: 1. 10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h,细胞增殖受到明显抑制(P﹤0.05),Spearman分析提示MC-LR染毒剂量与细胞增殖呈显著负相关(rs值=-0.767,P=0.000),有明显的剂量效应关系,因此选定48h作为MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞的最优作用时间,建立大鼠原代卵巢颗粒细胞MC-LR染毒模型。 2. 10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h,细胞培养液中MDA含量随着染毒剂量增加而增高,细胞内ROS含量也随着升高,同时细胞培养液中T-SOD活性随之下降;与对照组比较,20μg/ml、30μg/ml染毒组细胞培养液中MDA含量和细胞内ROS含量差异有统计学意义(P﹤0.05);与对照组比较,各剂量组细胞培养液中T-SOD活性差异均有统计学意义(P﹤0.05)。 3. 10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h,20μg/ml和30μg/ml剂量组细胞培养液中雌二醇(E2)、孕酮(P)含量显著降低,与对照组比较差异有统计学意义(P﹤0.05)。 4. 10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h,出现拖尾细胞数随剂量增加而增加,提示细胞DNA损伤逐步加重。 5. 10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h,随着染毒剂量升高卵巢颗粒细胞凋亡率升高。与对照组比较,20μg/ml和30μg/ml剂量组细胞凋亡率差异有统计学意义。 6. 10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h,细胞Bax基因表达上调, Bcl-2基因表达下调,与对照组比较,20μg/ml和30μg/ml剂量组Bax、Bcl-2基因表达量差异有统计学意义(P﹤0.05)。 结论: 1.体外实验条件下,MC-LR可引起卵巢颗粒细胞氧化应激损伤,使细胞内ROS水平升高,细胞培养液中T-SOD活性下降,MDA含量上升,呈现明显的剂量效应关系。 2.体外实验条件下,MC-LR具有卵巢颗粒细胞毒性,可明显抑制大鼠卵巢颗粒细胞的增殖,使颗粒细胞细胞凋亡率升高,DNA断裂水平增高,凋亡相关基因Bax表达上调和Bcl-2表达下调,分泌雌二醇(E2)和孕酮(P)能力降低,并有明显的剂量-效应关系。 3.不同剂量MC-LR引起大鼠卵巢颗粒细胞的氧化应激与细胞损伤的改变呈现良好的一致性,提示MC-LR通过诱导细胞内氧化应激而导致大鼠卵巢颗粒细胞的损伤,引起细胞凋亡,并引起细胞DNA损伤。MC-LR引起的细胞氧化应激可能是其造成卵巢颗粒细胞毒性的重要机制之一。


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