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乙肝病毒X基因(HBVX)慢病毒载体的构建和鉴定

陈豪  
【摘要】:目的:构建在正常组织来源的肝细胞HL7702表达的乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白的基因HBVX的重组慢病毒载体,研究其在体外的感染效率。 方法:采用PCR技术从先前构建的载体真核表达载体pcDNA3-X中扩增出含HBVX基因的DNA片段,用In-Fusion技术构建表达载体,经PCR、酶切和单向测序验证。利用jetPEI转染试剂三质粒共转染293T细胞,有限稀释法计算慢病毒颗粒的滴度。用慢病毒液感染正常组织来源的肝细胞HL7702,96 h后初步观察慢病毒颗粒的感染情况。Real-time PCR和Western blot法检测重组细胞HBV X基因的表达。 结果:成功构建HBVX基因的慢病毒表达载体,经293T细胞包装后,慢病毒颗粒浓缩后滴度为4x107IU/m1。用滴度为4x10~7IU/m1的慢病毒感染正常组织来源的肝细胞HL7702 96h后,被感染的细胞内可见强弱不等的荧光。Real-time PCR和Western blot检测均证实重组肝细胞有HBVX基因表达。 结论:成功构建乙肝病毒X基因(HBVX)慢病毒表达载体,为今后HBVX基因对肝细胞的影响的研究提供工具。


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