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Tie2基因RNAi慢病毒载体的构建及其干预恶性黑色素瘤细胞的体外研究

刘照亮  
【摘要】:目的:构建和鉴定携带Tie2-SiRNA基因的慢病毒载体,利用Tie2-SiRNA慢病毒载体介导RNA干扰作用来沉默Tie2基因在恶性黑色素瘤细胞中的表达,体外研究其对恶性黑色素瘤细胞中Tie2基因的抑制效率,为将来进一步进行裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤生长的体内抑制实验奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据。 方法: 1、首先利用限制性内切酶XbaⅠ将pSilencer1.0-U6-Tie2-siRNA重组质粒酶切成所需的目的片段U6-Tie2-siRNA,电泳鉴定。 2、利用限制性内切酶XbaⅠ酶切空载质粒pNL-EGFP,电泳鉴定。 3、将经XbaⅠ酶酶切电泳鉴定的空载质粒与电泳鉴定正确的目的片段U6-Tie2-siRNA以1:10浓度进行连接反应,构建pEGFP-Tie2-Ⅰ、pEGFP-Tie2-Ⅱ慢病毒转移质粒,电泳挑选阳性单克隆,测序鉴定。 4、将连接成功的pEGFP-Tie2-Ⅰ、pEGFP-Tie2-Ⅱ慢病毒转移质粒,分别与包膜质粒pVSVG和包装质粒pHelper一起组成慢病毒三质粒转染系统,按摩尔浓度1:1:1的条件共转染293T细胞,生产pEGFP-Tie2-Ⅰ、pEGFP-Tie2-Ⅱ慢病毒。 5、将收集到的病毒上清液按不同的浓度感染293T细胞,测定所收集的病毒原液的滴度。 6、将收集的病毒原液按不同的感染复数感染感染恶性黑色素瘤细胞,确定合适的感染复数。 7、在合适的感染复数条件下,将收集到的慢病毒原液感染恶性黑色素瘤细胞,通过实时荧光定量RT-PCR方法检测恶性黑色素瘤细胞中Tie2基因的表达量,进而得到RNA干扰沉默Tie2基因表达的效率。 结果: 1、成功利用限制性内切酶XbaⅠ从重组质粒pSilencer 1.0-U6-Tie2-siRNA中酶切出所需要的目的片段U6-Tie2-siRNA。 2、成功构建慢病毒转移质粒pEGFP-Tie2-Ⅰ、pEGFP-Tie2-Ⅱ,利用限制性内切酶XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,结果正确。 3、成功使用三质粒慢病毒转染系统构建了Tie2-SiRNA慢病毒载体,293T细胞测定病毒原液滴度为8.8×10~3/ml。 4、感染复数为80条件下,慢病毒感染恶性黑色素瘤细胞的效率为94.5%,实时荧光定量RT-PCR结果:Tie2-SiRNA慢病毒载体抑制了恶性黑色素瘤细胞中Tie2基因的表达,其中较高者可达到68.55%(P0.05),同时两种慢病毒载体之间的差异没有统计学的意义(P0.05)。 结论:成功使用三质粒转染系统构建了Tie2-SiRNA慢病毒载体,同时其能以较高的感染效率在体外感染恶性黑色素瘤细胞,且能抑制恶性黑色素瘤细胞的Tie2基因的表达,为下一步进行裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤生长的体内抑制实验奠定基础,提供实验依据。


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