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RNAi对乳腺癌乙酰肝素酶表达的体内外实验研究

陈国利  
【摘要】:目的: 1、构建HPSE-shRNA重组慢病毒表达载体,体外实验筛选出抑制乳腺癌细胞HPSE基因表达的siRNA序列。 2、通过Transwell侵袭小室测定实验研究抑制HPSE基因的表达对乳腺癌细胞侵袭力的影响。 3、构建乳腺癌模型,HPSE-shRNA重组慢病毒注射裸鼠移植瘤,通过实时定量PCR和免疫组化检测HPSE基因的表达,探讨在体内沉默HPSE的表达治疗乳腺癌的可行性,为以HPSE为靶点的乳腺癌基因靶向治疗提供一定的实验依据。 方法: 1、以慢病毒为载体,采用RNA干扰技术,筛选抑制乳腺癌细胞HPSE表达的siRNA序列:根据RNA干扰序列设计原则,设计并合成5对HPSE-shRNA序列,同时设立阴性对照序列。以pGPSV慢病毒载体系统构建表达HPSE-shRNA的慢病毒载体,经双酶切和测序鉴定。用293T细胞包装HPSE-shRNA重组慢病毒,保存在- 70℃冰箱。转染前病毒滴度采用有限稀释法复核,将重组慢病毒HPSE-602-shRNA1、HPSE-984-shRNA2、HPSE-1360-shRNA3、HPSE-1667-shRNA4、HPSE-1123-shRNA5、阴性对照慢病毒分别转染各组乳腺癌MDA-MB-231细胞,空白对照组未做任何处理。转染72h后,通过实时定量PCR和Western blot检测乳腺癌细胞HPSE基因mRNA和蛋白的表达。 2、Transwell侵袭小室检测乳腺癌细胞侵袭力:通过实时定量PCR和Western blot检测筛选出能够抑制HPSE基因表达的HPSE-602-shRNA1、HPSE-1667-shRNA4序列,包装成重组慢病毒,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞72h后,同时设立阴性对照组和空白对照组,通过Transwell侵袭小室测定法检测乳腺癌细胞侵袭力。 3、建立乳腺癌模型,注射重组慢病毒后,通过实时定量PCR和免疫组化检测HPSE表达:大量培养乳腺癌MDA-MB-231细胞,取1×10~9细胞/ml单细胞悬液0.2ml注射于雌性裸鼠右侧腋窝皮下脂肪组织。当肿瘤长至直径约1cm,32只裸鼠模型随机分4组,采用瘤体多点注射的方法分别将携带HPSE-602-shRNA1、HPSE-1667-shRNA4、HPSE-阴性对照的重组慢病毒(滴度1×10~8TU/ml)导入各组肿瘤灶,每只裸鼠总量400μl,隔日1次,共4次。重组慢病毒注射1个月后,手术完整取出肿瘤组织,每个肿瘤分为两部分,一部分保存在-70℃冰箱,实时定量PCR检测HPSE mRNA的表达,另一部分以甲醛固定,石蜡包埋,HE染色确定每个标本的病理类型,免疫组化检测HPSE蛋白的表达。 结果: 1、设计并合成5对HPSE-shRNA序列和阴性对照序列,经双酶切和测序证明成功构建HPSE-shRNA重组慢病毒载体,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞72h后,实验组和阴性对照组均有70%左右细胞发出绿色荧光,通过实时定量PCR和Western blot分别检测HPSE基因mRNA和蛋白的表达,结果显示:①实验HPSE-602-shRNA1组、HPSE-1667-shRNA4组HPSE基因mRNA和蛋白的相对表达量明显低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P0.05);②阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。说明在体外实验,实验HPSE-602-shRNA1组、HPSE-1667-shRNA4组均能有效抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞HPSE基因的表达。 2、HPSE-shRNA重组慢病毒转染乳腺癌MDA-MB-231细胞72h后,通过Transwell侵袭小室测定法检测乳腺癌细胞的侵袭力,结果显示:①实验HPSE-602-shRNA1组(6.2±0.73)、HPSE-1667-shRNA4组(8.7±0.41)侵袭细胞相对数明显低于阴性对照组(27.1±2.14)和空白对照组(24.7±1.83),差异有统计学意义(P0.05);②阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。说明HPSE-602-shRNA1、HPSE-1667-shRNA4抑制HPSE基因的表达后明显削弱了乳腺癌细胞的侵袭力。 3、成功构建裸鼠乳腺癌模型,HPSE-shRNA重组慢病毒注射1个月后,取出肿瘤组织,HE染色证明32个标本均是乳腺癌肿瘤组织,通过实时定量PCR和免疫组化分别检测肿瘤组织HPSE基因mRNA和蛋白的表达,结果显示:①实验HPSE-602-shRNA1组、HPSE-1667-shRNA4组HPSE基因mRNA和蛋白的相对表达量显著低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P0.05);②阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。表明在体内实验,实验HPSE-602-shRNA1组和HPSE-1667-shRNA4组均能沉默裸鼠乳腺癌移植瘤HPSE基因的表达。 结论: 1、成功构建HPSE-shRNA重组慢病毒表达载体,转染乳腺癌细胞,通过实时定量PCR和Western blot筛选出抑制HPSE基因表达的HPSE-602-shRNA1、HPSE-1667-shRNA4序列。 2、HPSE-shRNA重组慢病毒转染乳腺癌细胞后,通过Transwell侵袭小室实验证明抑制HPSE基因的表达明显削弱了乳腺癌细胞的侵袭力。 3、成功构建乳腺癌模型,注射HPSE-shRNA重组慢病毒后抑制了肿瘤组织HPSE基因的表达,说明在体内靶向沉默HPSE基因的表达治疗乳腺癌是可行的。


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