收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

脑红蛋白基因修饰的骨髓间充质干细胞对兔脊髓损伤保护作用的实验研究

林文平  
【摘要】:目的: 1.研究兔脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)后脑红蛋白(Neuroglobin, Ngb)表达的变化规律; 2.兔骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)体外分离、培养及鉴定; 3.构建Ngb重组慢病毒并利用其感染BMSCs; 4.将Ngb基因修饰的BMSCs植入兔SCI部位,观察其在脊髓内存活、基因表达、蛋白分泌以及对兔SCI的治疗作用; 5.探讨Ngb基因修饰的BMSCs保护SCI的可能机制。 方法: 1.采用球囊压迫制作兔脊髓不完全损伤模型;应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白质印迹(Western blot)法检测SCI后不同时间点损伤区脊髓组织中Ngb mRNA和蛋白的表达; 2.采用密度梯度离心与贴壁筛选法相结合培养BMSCs,用流式细胞仪检测BMSCs表面标记物; 3.构建携带Ngb基因的重组慢病毒载体,在脂质体Lipofectamine 2000作用下转染293T细胞,Real-time PCR检测慢病毒滴度;以Ngb重组慢病毒感染BMSCs,通过荧光表达法判定感染复数(Multiplicities of infection, MOI),Real-time PCR、Western blot和酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)判定感染后的BMSCs中Ngb的表达情况; 4.SCI兔分别给予NS、BMSCs、EGFP-BMSCs、LV-Ngb及Ngb-BMSCs治疗,通过BBB评分观察兔后肢运动功能;在荧光显微镜下观察损伤脊髓组织的荧光表达,Real-time PCR和Western blot法检测损伤脊髓组织中Ngb的表达; 5.丙二醛(Malondialdehyde, MDA)测试盒检测损伤脊髓组织中MDA水平的变化,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法( TdT-mediated UTP nick end labeling, TUNEL)检测凋亡指数(Apoptosis index, AI)的变化。 结果: 1.Ngb mRNA和蛋白在无损伤脊髓组织中即见有表达,SCI后6 h表达明显上调,与对照组比有显著性差异;随着损伤后时间的延长,表达逐渐增高,于损伤后24 h达到高峰,此后高表达仍持续至伤后72 h(与对照组比有非常显著性差异(P 0.01));72 h后表达逐渐减少,至本研究观察最后时间点SCI后7 d,表达明显下降,并接近正常水平,与对照组比无显著性差异(P 0.05) ; 2.成功分离、培养、扩增BMSCs,应用流式细胞仪检测BMSCs的表面标志,显示CD29、CD90表达阳性,而CD34、CD45表达阴性,符合BMSCs特征; 3.构建Ngb重组慢病毒载体,经酶切及测序鉴定完全正确,能够转染293T细胞并表达,滴度为2×108 TU/ml,Ngb重组慢病毒感染BMSCs最佳MOI值为100,且Ngb重组慢病毒感染BMSCs能持续稳定高水平表达Ngb mRNA和蛋白; 4.与NS组相比,BMSCs组、EGFP/BMSCs组、LV-Ngb组和Ngb/BMSCs组动物后肢运动功能明显改善,Ngb/BMSCs组改善最显著;EGFP/BMSCs组、LV-Ngb组和Ngb/BMSCs组损伤脊髓组织在荧光显微镜下可观察到有EGFP表达的绿色荧光信号;Real-time PCR和Western blot结果显示LV-Ngb组和Ngb/BMSCs组损伤脊髓组织中Ngb表达都增高,且Ngb/BMSCs组增高更明显; 5.与NS组相比,BMSCs组、EGFP/BMSCs组、LV-Ngb组和Ngb/BMSCs组动物的MDA水平及AI水平都明显下降,Ngb/BMSCs组下降最显著。 结论: 1.Ngb的表达变化与SCI的时间密切相关,其表达水平上调可能是机体的一种内源性保护反应; 2.通过密度梯度离心与贴壁筛选法相结合培养BMSCs,可得到纯度较高同源性较好的BMSCs,经多次传代仍保持稳定的生物学特性; 3.成功构建Ngb重组慢病毒,并将Ngb基因成功整合至BMSCs中,实现Ngb的持续稳定高水平表达; 4. Ngb基因修饰的BMSCs移植后可在SCI部位存活,并稳定持续高表达Ngb,明显地促进兔SCI后运动功能的恢复,对SCI具有保护作用; 5.Ngb基因修饰的BMSCs移植对SCI后的神经保护作用的可能机制是:通过抗氧化、抗凋亡来保护损伤脊髓。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 傅立波;陶朝阳;;CD151基因RNAi慢病毒载体构建与稳转细胞株建立[J];临床军医杂志;2008年03期
2 陈鹏;马忠森;王秀丽;李博;任锦;胡娱新;郏博;刘锋;石莹;;人HMGN5基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定[J];中国实验诊断学;2011年01期
3 孙梅;李金东;姜睿;高楠;金成彦;罗树立;王荣有;张兴义;;大鼠CD80基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定[J];中国免疫学杂志;2009年11期
4 宫玉波;黄一飞;黎燕;韩根成;刘勇;王大江;杜改萍;余继锋;;小鼠Foxp3基因慢病毒载体构建及其在DC2.4细胞的表达[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年07期
5 智深深;朱静;田杰;刘官信;鲁荣;林建萍;刘建平;;小鼠Islet-1基因RNAi慢病毒载体的构建[J];解放军医学杂志;2011年02期
6 张成静;陈仁富;温儒民;王军起;陈家存;郑骏年;孙晓青;;感染慢病毒HSV1-sr39tk的肾癌细胞GRC-1的建立[J];徐州医学院学报;2008年12期
7 曾四平;章小平;肖亚军;;Has-miR-129慢病毒表达载体的构建[J];临床合理用药杂志;2010年09期
8 王峰;陈琳;邵建国;;慢病毒绿色荧光蛋白感染人胰腺癌细胞株CFPAC-1的效率观察[J];南通大学学报(医学版);2008年01期
9 陈云;孙倍成;刘根焰;王芳;;靶向PCSK9基因shRNA慢病毒载体的构建及其对PCSK9基因表达的沉默[J];中国分子心脏病学杂志;2009年05期
10 黄馨;石桂英;陈显达;鞠振宇;;shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中的长期高效表达[J];军事医学科学院院刊;2010年05期
11 李明峰;侯静;熊伟民;邸立军;任军;;携带AFP基因慢病毒载体制备并感染树突状细胞的实验研究[J];细胞与分子免疫学杂志;2009年09期
12 王孟丽;沈晓丽;韩莉莉;林丽芳;浦晓东;;慢病毒载体感染人皮肤成纤维细胞的研究[J];中华实用诊断与治疗杂志;2009年12期
13 章瑜;俞康;;慢病毒介导的RNAi对人多发性骨髓瘤DKK1基因表达的抑制作用[J];医学研究杂志;2010年06期
14 张徐;钱晖;朱伟;曹慧玲;徐学静;司煜安;王梅;许文荣;;慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究[J];江苏大学学报(医学版);2008年02期
15 陈丽丽;虢灿杰;陈源文;李定国;;大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达[J];上海交通大学学报(医学版);2010年10期
16 刘真;甄艳;于晓黎;江庆萍;龙捷;方唯意;;人NESG1基因慢病毒载体的构建及其在293FT细胞中的表达[J];南方医科大学学报;2011年01期
17 杨东昌;母小新;刘巧玉;邓蕾;陈云;孙倍成;;人膜连蛋白A2基因重组慢病毒载体的构建及其在肝癌细胞株中的表达[J];南京医科大学学报(自然科学版);2011年02期
18 潘松;付勇;刘强;刘立思;刘杰;;Math1基因重组慢病毒的构建及其在293T细胞中的表达[J];中国现代医学杂志;2011年04期
19 孙强明;潘玥;赵玉娇;陈俊英;施海晶;马绍辉;;人Semaphorin 4D慢病毒载体的构建及鉴定[J];中国生物工程杂志;2011年07期
20 韩腾龙;王立峰;张璟;刘新平;药立波;;pWPT-GFP慢病毒载体的改构及鉴定[J];现代生物医学进展;2010年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 于洁;高书颖;;携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年
2 高书颖;于洁;;携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年
3 王海彬;;雌激素相关受体α基因超表达慢病毒载体的构建[A];中华医学会第六次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议暨中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会成立十周年论文汇编[C];2011年
4 薛美思;刘毅;;携带人胰岛素基因慢病毒载体转染脐带间充质干细胞的实验研究[A];中华医学会整形外科学分会第十一次全国会议、中国人民解放军整形外科学专业委员会学术交流会、中国中西医结合学会医学美容专业委员会全国会议论文集[C];2011年
5 陈帅;李浩博;李牧;李双;赵培林;;基于树突状细胞的肿瘤疫苗构建及其抗肿瘤效应研究[A];中国解剖学会2011年年会论文文摘汇编[C];2011年
6 刘竞;余锋;桂嵘;李昕;蒋铁斌;王二华;李颖;王成红;唐雪元;陈方平;;Survivin shRNA慢病毒载体构建[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
7 蔡伟光;丁景华;习欠云;肖敏;江青艳;吴珍芳;张永亮;;慢病毒与精子孵育法介导转基因猪的制备[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
8 王泽;党源;刘佳旭;杨建新;郭育培;张晓东;丁壮;;鹅源副粘病毒NP、M基因RNA干扰慢病毒载体构建及鉴定[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
9 王旭东;仲人前;;慢病毒载体介导microRNA-21抑制体的构建与转染[A];2010’全国肿瘤分子标志及应用学术研讨会暨第五届中国中青年肿瘤专家论坛论文汇编[C];2010年
10 苗凯;郭敏;安磊;许晓玲;武韩;王栋;吴中红;田见晖;;低滴度慢病毒生产转基因胚胎和小鼠的新方法[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 林文平;脑红蛋白基因修饰的骨髓间充质干细胞对兔脊髓损伤保护作用的实验研究[D];福建医科大学;2011年
2 林恒;线粒体转录因子A在重组人肝再生增强因子对梗阻性黄疸大鼠肝功能保护中的作用机制研究[D];第三军医大学;2009年
3 刘瑜;BTBD10在人脑胶质瘤中的表达及其对U251细胞株增殖和凋亡的影响[D];第二军医大学;2010年
4 王鹏;依赖p53的癌基因Wip1在人脑胶质瘤细胞恶性增殖机制中的作用研究[D];华中科技大学;2010年
5 苏冠华;肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植的促血管新生作用[D];华中科技大学;2010年
6 韦烨;基因改造骨髓造血干细胞靶向抑制结直肠癌新生血管形成的实验研究[D];复旦大学;2010年
7 俞晓岚;过表达CXCR4的骨髓间质干细胞移植治疗大鼠脑梗死的疗效观察[D];福建医科大学;2010年
8 罗远材;PKR/EIF2α信号传导通路与宫颈癌关系研究[D];天津医科大学;2010年
9 胡晓;雌激素受体α对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的抑制作用[D];重庆医科大学;2011年
10 陈春经;慢病毒载体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰肌源性干细胞移植治疗雌性压力性尿失禁大鼠的实验研究[D];福建医科大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈春;携带大鼠Foxp3基因慢病毒载体的构建及慢病毒包装的研究[D];安徽医科大学;2011年
2 陈豪;乙肝病毒X基因(HBVX)慢病毒载体的构建和鉴定[D];福建医科大学;2011年
3 马贵亮;慢病毒载体介导的TNF-α基因在脐血间充质干细胞中的表达的实验研究[D];青岛大学;2010年
4 姚志芳;人诱导性多潜能干细胞(iPS)系的建立[D];南方医科大学;2010年
5 张晓宇;含LfcinB基因慢病毒载体的构建及体外对SKOV3细胞作用的研究[D];安徽医科大学;2011年
6 智深深;Islet-1在C_3H_(10)T1/2细胞向心肌样细胞特异性分化过程中的作用研究[D];重庆医科大学;2011年
7 张国峰;慢病毒载体介导的RNAi抑制牛整联蛋白亚基αv基因表达的研究[D];中国农业科学院;2011年
8 卫冰冰;慢病毒载体介导的HIV-1Tat对人前列腺癌PC-3细胞体外增殖和迁移的影响[D];南京医科大学;2010年
9 刘照亮;Tie2基因RNAi慢病毒载体的构建及其干预恶性黑色素瘤细胞的体外研究[D];福建医科大学;2011年
10 毛贺辉;shRNA抑制FAK表达治疗大肠癌转移的体外实验研究[D];福建医科大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 广知;多种因素易致“痴”[N];医药经济报;2004年
2 余海若;诺贝尔奖为何13次关注传染病[N];大众科技报;2004年
3 辛紫;中国俩科学家创新项目入选[N];医药经济报;2009年
4 本报记者 郑灵巧;十万美元验证一个新点子[N];健康报;2009年
5 张田勘;基因疗法:沉寂之后的复苏?[N];南方周末;2009年
6 记者 任海军;基因疗法卷土重来 人类顽疾有望治愈[N];经济参考报;2010年
7 记者 徐亚静;抑制VCAM——1表达可减少颈动脉术后再狭窄[N];中国医药报;2010年
8 记者 师巧梅;我区绵羊转基因研究取得重大突破[N];新疆日报(汉);2010年
9 记者 王菲 胡江;新疆科学家“破解”绵羊转基因技术“密码”[N];新疆科技报(汉);2010年
10 记者 王小龙;人造病毒可给艾滋病病毒定位[N];科技日报;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978