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抑制Notch1、4受体基因的表达对涎腺腺样囊性癌细胞增殖、侵袭以及迁移的影响

曲静  
【摘要】:涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC),是头颈部常见的恶性肿瘤之一,具有嗜神经侵袭和远处转移两大生物学特点,术后易复发。众多的研究表明,Notch信号通路与肿瘤的发生发展有关。本课题组前期实验发现,Notch信号通路中的受体基因Notch1、4在涎腺腺样囊性癌高转移细胞株SACC-M中表达明显高于低转移细胞株SACC-2。本研究以Notch1、4为研究对象,研究其与涎腺腺样囊性癌细胞增殖、侵袭及迁移的关系。研究分为两个部分,分述如下: 一、用siRNA技术研究Notch1、4基因对涎腺腺样囊性癌细胞功能的影响 目的:验证Notch1、4受体基因与涎腺腺样囊性癌细胞增殖、侵袭以及迁移的关系。 方法:根据Notch1、4的序列设计合成siRNA,转染SACC-M细胞,应用Real-time PCR技术,研究其Notch1、4的表达变化;用CCK8法研究Notch1、4表达被抑制后SACC-M细胞增殖能力的变化;采用侵袭小室法研究Notch1、4表达被抑制后SACC-M细胞侵袭迁移能力的改变。 结果:Real-time PCR检测结果显示Notch1、4的表达下降;CCK8法研究发现转染72h后,转染siRNA的SACC-M细胞增殖能力弱于阴性对照组;侵袭小室法研究结果表明,Notch1、4表达下降后,SACC-M细胞的侵袭、迁移能力也随之下降。 结论:Notch1、4对SACC-M的增殖、侵袭以及迁移能力有影响。 二、Notch1、4基因shRNA重组腺病毒载体的构建 目的:构建重组腺病毒载体。 方法:根据文献选取的Notch1、4的siRNA序列,设计合成带有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点的shRNA片段;穿梭载体pRNAT-H1.1/Adeno行HindⅢ、XhoⅠ双酶切后与shRNA片段连接,转化E.coliDH5α,鉴定正确的质粒命名为pRNAT-H1.1-Notch1-1、pRNAT-H1.1-Notch1-2、pRNAT-H1.1-Notch4-1和pRNAT-H1.1-Notch4-2;用Pme I酶切线性化重组穿梭质粒,转化Bj5183进行同源重组,Pac I酶切鉴定获重组腺病毒载体pAd-Notch1-1、pAd-Notch1-2、pAd-Notch4-1、pAd-Notch4-2;将pAd-Notch1-1、pAd-Notch1-2、pAd-Notch4-1、pAd-Notch4-2PacI酶切线性化后按脂质体法转染AD-293进行包装;通过荧光显微镜观察细胞GFP的表达,待贴壁细胞变圆脱落后,收集培养液上清及细胞,获取第一代病毒液,并扩增至第五代。病毒感染SACC-M后,用Real-time PCR验证干扰效果。 结果:Real-time PCR检测针对Notch1基因的shRNA重组腺病毒载体干扰效果达到50%以上;针对Notch4基因的shRNA重组腺病毒载体干扰效果不佳。 结论:成功构建了针对Notch1基因shRNA重组腺病毒载体,干扰效果较理想;针对Notch4基因的shRNA腺病毒载体构建成功,但干扰效果尚不理想。


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