RNA干扰技术沉默Gab1基因抑制血管生成的体外实验研究

【摘要】：目的 探讨应用RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术沉默Gab1基因使其在体外抑制血管生成的研究，为进一步进行抑制肿瘤血管生成和其他血管性疾病的实验研究奠定基础，为肿瘤和其他血管性疾病的基因治疗提供实验依据。 方法 1、采用含10%胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)作为培养基，获取3—7代EA.hy926细胞。 2、以Gab1的mRNA已知序列为靶点，构建LV-Gab1-siRNA慢病毒载体，转染EA.hy926细胞，获取Gab1基因特异的siRNA干扰EA.hy926细胞。 3、在24孔培养板上,将配好的基质胶工作液以200~250ul/cm2的量加入孔中，建立体外血管生成的三维培养模型。取P4代EA.hy926细胞随机分成3组（n=8）：空白对照组为正常EA.hy926细胞接种组（n=8），EA.hy926细胞直接接种到含三维培养模型的孔板中；阴性对照组为无关序列(LV-scr-siRNA)转染组（n=8），操作与空白对照组相同，但是细胞经过基因Scr特异的siRNA慢病毒载体转染；干扰组为Gab1基因特异的siRNA干扰组（n=8），操作与空白对照组相似，但细胞经过慢病毒介导Gab1基因特异的siRNA干扰。 4、将24孔培养板置于培养箱中，24h后镜下观察血管样结构情况（数目、长度）。 5、以上3组中的一部分EA.hy926细胞用于逆转录-聚合酶连反应(Real-timePCR)和western blotting实验，检测Gab1的mRNA和蛋白质表达水平；采用Tanswell小室迁移实验检测3组细胞的迁移能力；用流式细胞仪检测细胞凋亡。 结果 1、EA.hy926细胞慢病毒转染3d后，在荧光倒置显微镜下观察到明显的绿色荧光。 2、慢病毒干扰组细胞形态变化明显，由长梭形逐渐变成星形或多角形，而阴性和空白对照组细胞变化不明显，呈梭形。 3、RT-PCR检测结果显示：慢病毒干扰组Gab1基因mRNA的表达水平明显受抑制（P0.05），而空白和阴性对照组之间均无明显差异(P0.05)。 4、Western blot检测证实慢病毒干扰组未见阳性条带，而阴性和空白对照组在110KDr均出现特异行条带。 5、小室迁移实验显示：干扰组迁移细胞数量较空白组和阴性对照组明显减少（P0.05）,而空白组和阴性对照组迁移的细胞数相近（P0.05）。 6、流式细胞仪检测三组细胞凋亡显示：干扰组细胞凋亡比例较空白组和阴性对照组细胞均明显高（P0.05），而空白组和阴性对照组之间没有明显区别（P0.05）。 7、LV-Gab1-siRNA转染后的EA.hy926细胞在体外三维培养模型中血管样结构形成的数量和长度均明显减少(P0.05)，表明血管生成受到明显抑制。结论 Gab1-siRNA能够抑制EA.hy926细胞中Gab1基因的mRNA及其蛋白的表达，从而细胞迁移能力也减慢，细胞凋亡加快，最终抑制体外血管生成，可以推测Gab1基因在血管生成方面起着重要的作用。