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大黄素衍生物对慢性粒细胞白血病细胞株K562及其伊马替尼耐药株K562/G01的作用及机制研究

李博君  
【摘要】:目的设计合成10种大黄素衍生物,从中筛选出抑制白血病细胞增殖作用较强的衍生物;研究大黄素衍生物对慢性粒细胞白血病细胞株K562及其耐伊马替尼细胞株K562/G01增殖、凋亡的影响;观察大黄素衍生物对K562、K562/G01细胞增殖、凋亡相关蛋白表达的影响;观察大黄素衍生物对P210Bcr-Abl、磷酸化P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl)及其下游PI3K/Akt/mTOR、MAPK等信号通路的作用。 方法以大黄素为母体合成10种大黄素衍生物,用MTT法检测各种大黄素衍生物对白血病细胞株增殖的影响。细胞株包括P210Bcr-Abl表达阳性的CML细胞株K562细胞、耐ADM的KAR细胞、耐IM的K562/G01细胞。从中筛选出大黄素衍生物E19进行实验。MTT比色法及细胞集落形成实验观察大黄素衍生物E19对K562、K562/G01细胞增殖的影响;DAPI染色法荧光显微镜下观察衍生物作用后的细胞形态变化;DNA片段化检测大黄素衍生物E19诱导细胞凋亡的作用;蛋白印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白Bcl-2、c-Myc、procaspase-9、cleaved Caspase-3、PARP,并检测P210Bcr-Abl、磷酸化P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl)及其下游信号通路的PI3K/Akt/mTOR、MAPK等信号分子的变化。 结果1、MTT结果显示,各种大黄素衍生物对K562细胞、KAR细胞及K562/G01细胞的增殖抑制作用不同,大部分大黄素衍生物对KAR细胞没有明显的增殖抑制作用,而对K562细胞、K562/G01细胞有较强的抑制增殖作用。从中筛选出抑制作用较强的衍生物E19进行研究。2、MTT法显示大黄素衍生物E19作用K562、K562/G01细胞48h的半数抑制浓度(IC50)分别为1.1966±0.1949μmol/L和1.2157±0.1642μmol/L,两者相接近,并呈时间及剂量依赖方式抑制K562细胞、K562/G01细胞的增殖。3、细胞集落形成实验均显示大黄素衍生物E19能明显抑制两种细胞集落的形成,并在一定范围内呈浓度依赖性。4、DAPI染色后在荧光显微镜下能看到E19作用后K562、K562/G01细胞出现典型的凋亡形态学改变;DNA片段化检测可观察到DNA凋亡梯带。5、Western blot结果显示,大黄素衍生物E19作用K562、K562/G01细胞后,Bcl-2、c-Myc、PARP、Caspase-9、P210Bcr-Abl、p-P210Bcr-Abl、p-MAPK、p-AKT、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、p-P70表达均下调,cleaved Caspase-3表达上调,P70、AKT、MAPK、mTOR的表达变化趋势不明显,调节方式呈时间和浓度依赖性。 结论在合成的10种大黄素衍生物中,E19对K562、K562/G01细胞有明显的抑制增殖、诱导凋亡的作用,这一过程中,P210Bcr-Abl、p-P210Bcr-Abl及其下游的信号转导通路PI3K/Akt/mTOR、MAPK活化受抑制发挥重要作用。


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