瘦素基因修饰组织工程化复合物对骨质疏松状态下牙周组织再生的作用研究

【摘要】：目的用携带人瘦素(human leptin,h LEP)基因的腺病毒Ad-h LEP-EGFP感染骨质疏松大鼠骨髓基质细胞(osteoporotic rat bone marrow stromal cells,O-r BMSCs),并与β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)复合构建h LEP修饰的组织工程化复合物,分别将其移植入裸鼠背部皮下和骨质疏松大鼠牙周骨缺损处,探讨h LEP基因修饰的组织工程化复合物的成骨能力及其对骨质疏松状态下牙周组织再生的作用。方法1.双侧卵巢摘除术构建SD大鼠骨质疏松模型,通过体型体重比较、骨密度测定和组织学形态学观察鉴定模型构建成功与否;2.全骨髓贴壁法体外分离培养O-r BMSCs和正常大鼠骨髓基质细胞(sham rat bone marrow stromal cells,S-r BMSCs),比较二者增殖活性和成骨分化能力的差异;3.构建并鉴定携带h LEP基因的腺病毒Ad-h LEP-EGFP,将其感染O-r BMSCs,通过荧光观察、流式细胞术、RT-PCR、western blot、ELISA及免疫细胞化学等方法检测感染后O-r BMSCs中h LEP的基因和蛋白表达;4.通过形态学和荧光表达观察、MTT增殖曲线检测、碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)活性测定、矿化结节染色和定量分析以及成骨相关基因Runx2(runt-related transcription factor 2)、ALP、Ⅰ型胶原(collagen type?,Col-?)和骨钙素(osteocalcin,OC)的荧光定量表达检测等方法,探讨h LEP基因感染对O-r BMSCs生物学行为的影响;5.将h LEP基因修饰后的O-r BMSCs与β-TCP体外复合培养,构建h LEP基因修饰的组织工程化复合物,通过荧光显微镜、扫描电镜观察细胞在β-TCP上结合及生长增殖情况;6.将构建成功的h LEP基因修饰的组织工程复合物移植入裸鼠皮下,4w和8w后取材制作组织学切片,HE和Masson染色进行组织形态学观察和测量,探讨h LEP基因修饰的组织工程化复合物体内异位成骨情况;7.于骨质疏松大鼠右侧下颌骨制备牙周缺损,以构建骨质疏松大鼠牙周缺损模型,将h LEP基因修饰的组织工程化复合物植入牙周组织缺损内,分别于术后10d和28d取术侧下颌骨制作组织切片,行HE染色观察并分析牙周组织再生情况,评价h LEP基因修饰的组织工程化复合物对骨质疏松状态下牙周组织再生的作用。结果1.成功构建SD大鼠骨质疏松模型,其体型明显变胖,体重明显增加,骨密度减小,松质骨变得稀疏;2.成功分离培养了O-r BMSCs和S-r BMSCs,前者较后者增殖活性和成骨分化能力减弱;3.成功构建Ad-h LEP-EGFP,且能高效感染O-r BMSCs,72h的感染效率达84.5%,表达出较强的绿色荧光,基因和蛋白两个层面多方位检测均能发现感染后O-r BMSCs中h LEP的有效表达;4.h LEP基因感染后O-r BMSCs形态无明显改变,增殖能力不受影响,ALP活性增强,矿化结节形成能力提高,Runx2、ALP和Col-?的基因表达上调;5.成功构建h LEP基因修饰的组织工程化复合物,感染后各组细胞与β-TCP均能有效结合并生长良好;6.h LEP基因修饰的组织工程化复合物植入裸鼠皮下8w后,Ad-h LEP-EGFP组形成的骨样结构最多(P﹤0.05);7.h LEP基因修饰的组织工程化复合物植入大鼠牙周缺损后发现Ad-h LEP-EGFP组的新生牙槽骨(new alveolar bone,NB)面积最大(P﹤0.05),Ad-EGFP组和OVX组之间NB无差异(P﹥0.05),但都比β-TCP组NB面积大(P﹤0.05);各组之间新生牙周膜(new periodontium,NP)宽度没有显著差异(P﹥0.05)。结论骨质疏松状态下大鼠BMSCs增殖及分化能力减弱。h LEP基因修饰可显著提高O-r BMSCs的成骨能力,以h LEP腺病毒载体可介导h LEP基因在O-r BMSCs中有效表达。h LEP基因修饰的O-r BMSCs为种子细胞所构建的组织工程化复合物不仅具有体内异位成骨的能力,还可实现骨质疏松大鼠牙周组织缺损的再生修复,有望应用于牙周组织工程研究与治疗。