程序性坏死和凋亡在HBx诱导小鼠肝组织炎症损伤中的作用

【摘要】：目的通过构建表达HBx基因的小鼠模型,评估HBx诱导肝组织炎症损伤的情况,分析程序性坏死和凋亡的作用,探讨HBx诱导小鼠肝组织炎症损伤的机制;用抗氧化剂NAC进行干预,分析NAC对HBx诱导的程序性坏死和凋亡的影响,探讨NAC对HBx诱导的小鼠肝组织炎症损伤的作用。方法(1)成年雄性ICR小鼠25只随机平均分成HBx组、Control组、payw1.2组、payw*7组和Mock组,将质粒pcDNA3.1-flag-HBx、pcDNA3.1、pGEM-HBV(payw1.2)、pGEM-HBV-?HBx(payw*7)和转染试剂通过尾静脉快速注射到小鼠体内,24h后眼眶取血并取肝组织,RT-PCR和Western blot检测肝组织中HBx mRNA和蛋白的表达情况,ELISA检测血清中HBsAg的表达情况,ELISA和qPCR分别检测血清和肝组织中TNF-α的表达情况,组织切片行HE染色观察肝脏的组织学形态,qPCR检测肝组织中RIP3、JNK、Bcl-2/Bax、Caspase8、Caspase3 mRNA的表达情况,Western blot检测肝组织中RIP3、JNK和磷酸化JNK蛋白的表达情况;(2)成年雄性ICR小鼠16只随机平均分成HBx组、HBx+NAC组、pc组和pc+NAC组,将质粒pcDNA3.1-flag-HBx、pcDNA3.1和转染试剂通过尾静脉快速注射到小鼠体内,干预组在转染前0.5h腹腔注射NAC,转染24h后取肝组织,RT-PCR检测肝组织中HBx mRNA的表达情况,qPCR检测肝组织中TNF-α、RIP3、JNK、Bcl-2/Bax、Caspase8、Caspase3 mRNA的表达情况。结果(1)RT-PCR和Western blot结果均显示HBx组肝组织中有HBx基因的表达;ELISA结果显示payw1.2组和payw*7组血清中均有HBsAg的表达,且payw1.2组较payw*7组有所上调(P0.05),HBx组血清中TNF-α的表达较Control组显著上调(P0.0001),payw1.2组与payw*7组无明显差异;qPCR结果显示HBx组肝组织中TNF-α、RIP3的表达较Control组明显上调(P0.01),JNK、Bcl-2的表达也有所上调(P0.05),Caspase8、Caspase3的表达下调(P0.05),Bax的表达无明显差异,payw1.2组肝组织中TNF-α、Bcl-2的表达较payw*7组上调(P0.05),RIP3、JNK、Bax、Caspase8、Caspase3的表达均无明显差异;组织切片HE染色结果显示除Control组外各组肝组织均有不同程度的病理学改变;Western blot结果显示HBx组肝组织中RIP3的表达较Control组明显上调(P0.01),JNK的表达水平无明显差异但磷酸化水平上调,payw1.2组与payw*7组的RIP3、JNK表达水平和JNK磷酸化水平均无明显差异;(2)RT-PCR结果显示HBx+NAC组和HBx组肝组织中均有HBx基因的表达;qPCR结果显示pc+NAC组肝组织中Bcl-2的表达较pc组明显上调(P0.01),Caspase3的表达显著下调(P0.001),TNF-α、RIP3、JNK、Bax、Caspase8的表达均无明显差异;HBx+NAC组肝组织中RIP3的表达较HBx组明显下调(P0.01),TNF-α、Bcl-2、Caspase3的表达也有所下调(P0.05),Bax的表达显著上调(P0.001),Caspase8的表达也有所上调(P0.05),JNK的表达无明显差异;HBx+NAC组肝组织中JNK、Bax的表达较pc+NAC组明显上调(P0.01),TNF-α、RIP3的表达也有所上调(P0.05),Bcl-2、Caspase8、Caspase3的表达均无明显差异。结论HBx可以促进HBV的复制,并通过诱导程序性坏死和抑制凋亡介导小鼠肝组织的炎症损伤;NAC可以抑制HBx诱导的程序性坏死,从而减轻小鼠肝组织的炎症损伤。