基于组学数据探索胰腺癌和结直肠癌耐药及其逆转机制

【摘要】：胰腺癌和结直肠癌都是常见且恶性程度较高的消化道肿瘤,化疗是其主要的治疗手段。胰腺癌因其发生隐匿,进展迅速,大多数患者诊断时已失去手术的机会只能采取化疗等手段来延缓病情,延长生存期。相对于胰腺癌,结直肠癌可通过肠镜等方法进行早期筛查,然而由于肠镜的普及率较低,大多数患者在确诊时已经存在转移,因此也需要化疗来控制病情、配合手术前后的辅助治疗。接受化疗的患者在治疗初期通常病情会有好转,但是在后续治疗中因为化疗耐药,肿瘤会复发甚至转移。所以找到肿瘤耐药机制、逆转肿瘤的耐药,寻找肿瘤耐药及逆转的靶向基因或通路,对于指导临床治疗、提高化疗疗效具有重要的理论和实际意义。本实验为了研究胰腺癌的5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)耐药机制,采用药物连续诱导的方法自行构建了人胰腺癌5-Fu耐药细胞株Aspc-1/5-Fu和Bx PC-3/5-Fu。同时,我们从国家实验细胞资源共享平台购买了人结直肠癌耐长春新碱(Vincristine,Oncovin,VCR)细胞株HCT-8/VCR及其亲本细胞系HCT-8。随后,应用药物重定位策略(老药新用),使用五种“老药”(阿司匹林、褪黑素、二甲双胍、叶酸和地西他宾)来处理HCT-8/VCR和As PC-1/5-Fu和Bx PC-3/5-Fu耐药细胞株,发现褪黑素和阿司匹林对于逆转HCT-8/VCR细胞系长春新碱耐药和As PC-1/5-Fu和Bx PC-3//5-Fu细胞株对于5-Fu耐药具有很好作用。采用本课题组设计的药物处理方法,来探索获得性耐药细胞在转录组和表观遗传组之间可能存在的联系。以As PC-1和As PC-1/5-Fu为例,先将这两种细胞在无5-Fu的培养基中培养48小时以消除可能存在的药物残留影响,再使用5-Fu处理,对取处理0h、24h和48h的As PC-1和As PC-1/5-Fu细胞系样本进行RNA-seq测序检测基因表达谱;取处理0h和48h的样本进行甲基化检测。再分别取经阿司匹林和褪黑素处理的这两类细胞系样本同时进行RNA-seq测序和甲基化检测。对于得到的基因表达谱数据,本研究采用本课题组设计的专为小样本细胞系开发的差异表达基因识别算法Cell Comp以识别胰腺癌和结直肠癌相关耐药基因并进行通路富集分析以识别药物作用相关基因和通路。对于结直肠癌,阿司匹林和褪黑素逆转HCT-8/VCR细胞系长春新碱耐药相关基因同时富集到Cell cycle和Cellular senescence通路,这两个通路也被在阿司匹林逆转5-Fu耐药过程中同时发生表达和甲基化改变的基因所富集到。所以这两个通路可能是在HCT-8/VCR长春新碱耐药及阿司匹林和褪黑素逆转其耐药过程中发挥关键作用的通路。对于胰腺癌,其5-Fu耐药细胞系As PC-1/5-Fu和BXPC-3/5-Fu的5-Fu耐药相关基因同时富集到TNF signaling pathway和Epstein-Barr virus infection这两个通路。阿司匹林和褪黑素逆转As PC-1/5-Fu细胞系5-Fu耐药基因同时富集到Epstein-Barr virus infection通路,暗示该通路可能在阿司匹林和褪黑素逆转胰腺癌5-Fu耐药中发挥重要作用。通过对Epstein-Barr virus infection通路进一步研究发现其中的HDAC2基因是经过阿司匹林和褪黑素处理后发生逆转的耐药基因,并且该基因与接受5-Fu-based化疗方案的胰腺癌患者的生存显著相关,提示HDAC2基因可能在胰腺癌5-Fu耐药中有重要作用。通过整合STRING数据库的蛋白质互作网络和胰腺癌细胞系的共表达关系,本课题发现阿司匹林可以通过HDAC2/TP53/TYMS通路达到一定程度逆转As PC-1/5-Fu细胞对5-Fu的耐药性。本课题首先构建了2株胰腺癌耐药细胞株,并利用基因测序找出肿瘤(胰腺癌和结直肠癌)耐药细胞株与亲本细胞株之间差异表达的基因和差异甲基化基因,丰富了肿瘤耐药相关机制。然后采用5种“老药”进行逆转耐药实验,同时运用本课题组设计的专为小样本细胞系开发的差异表达基因识别算法Cell Comp识别胰腺癌和结直肠癌相关耐药基因,并进行通路富集分析以识别药物作用相关基因和通路。本课题为胰腺癌和结直肠癌的防治提出了开放性的临床治疗思路,具有广泛的理论与应用价值。