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CLK1对胰腺癌细胞的凋亡基因调控作用的研究

覃春涛  
【摘要】:背景胰腺癌的恶性程度在多种癌症中都位于前列,其恶性度非常高,发展十分迅速,预后往往很差。胰腺癌在明确诊断的时候通常已经到了恶性程度非常高的阶段,5年死亡率超过94%。CLK1是调控RNA可变剪接的一种重要的蛋白激酶,参与了多种癌症的发生发展。人工促进胰腺癌的细胞凋亡是目前治疗中一种常用的手段。本文旨在探究可能影响CLK1对胰腺癌的细胞凋亡的机理,在寻求胰腺癌的最佳治疗用药方面给出理论支持。方法(1)、我们利用Westeran Blot检测Pan C1-sh CLK1、Bxpc3、Bxpc3-CLK1(+)胰腺癌细胞系中CLK1表达水平。CLK1表达水平改变后,采用流式细胞仪将Pan C1及Bxpc3细胞的凋亡水平变化进行分析。(2)、我们采用CLK1阻滞药物(TG003)干预胰腺癌细胞系,Qrt-PCR检测细胞凋亡相关基因的表达改变。我们将Pan C1细胞用TG003进行干预,另一组将TG003换成DMSO,并用Western Blot分析Pan C1胰腺癌细胞凋亡有关基因的蛋白表达水平。接着利用TG003处理Pan C1胰腺癌细胞,Western Blot检测c-Caspase3、cytochrome C、Apaf-1在胰腺癌细胞中的蛋白表达情况。我们用Image J将上述有差异的结果进行统计分析。(3)、我们采取TG003和DMSO分别处理胰腺癌细胞系,对两组细胞进行蛋白质组质谱分析和生物信息学归纳分析表达差异蛋白。我们分别对Pan C1和Bxpc3胰腺癌细胞系利用RNA-Seq分析TG003处理组与DMSO处理组的可变剪接事件。结果(1)、蛋白质免疫印迹实验显示:Pan C1-sh CLK1细胞中CLK1在蛋白水平低表达,Bxpc3-CLK1(+)细胞中成功过表达CLK1。流式细胞分析技术显示:在高表达CLK1的Pan C1细胞中减少CLK1,细胞的凋亡会增加,但是在低表达CLK1的Bxpc3细胞过表达CLK1后细胞的凋亡会减少。(2)、在Pan C1细胞中抑制CLK1的产生,和用DMSO处理的细胞对比,Bax在基因表达水平方面显著增加,并且其蛋白上的表达水平也明显增加。Bcl2在基因表达水平方面显著下降,并且在其蛋白上的表达水平也明显下降。Caspase3在基因这个层面上表达水平是上升的,但是其蛋白表达水平却没有变化。对Caspase3的激活性能检测结果显示,c-Caspase3表达能力升高,且激活性能增强。(3)、胰腺癌细胞蛋白质组质谱分析结果显示抑制CLK1后,胰腺癌细胞中有约220种蛋白质磷酸化发生改变,其中m RNA剪接相关蛋白变化最为显著,RNA-Seq结果显示细胞可变剪接事件受到抑制。结论1、CLK1的表达水平变化会影响胰腺癌细胞凋亡的发生。2、CLK1可以通过影响细胞凋亡相关基因Bax、Bcl2的表达及caspase3的激活影响胰腺癌细胞凋亡。3、抑制CLK1表达,胰腺癌细胞可变剪切事件减少。


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