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中药紫龙金对人胃癌BGC—823细胞生长、增殖、侵袭及相关基因表达的作用

谢贤和  
【摘要】: 紫龙金是我国治疗肿瘤的一种有效的民间验方。经多次实验,我们发现该药对胃癌BGC-823细胞G2期具有阻滞作用,并能影响癌细胞的生长、增殖及侵袭力。我们用基因芯片结合流式细胞术、RT-PCR、Western-blot等技术检测紫龙金对胃癌-823细胞基因表达的影响,旨在进一步探讨紫龙金抗肿瘤作用的分子机制。 一.本文的研究内容包括以下四部分: 1.紫龙金对人胃癌BGC—823细胞生长、增殖的影响: (1)生长曲线绘制:观察紫龙金、HMBA(六亚甲基二乙酰胺)对人胃癌BGC—823细胞生长状况的影响。 (2)软琼脂集落形成实验:观察紫龙金对人胃癌BGC—823细胞集落形成状况并照相。 2.基因芯片检测紫龙金对人胃癌BGC—823细胞基因差异表达: 细胞培养:人胃癌BGC—823细胞用含15%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、5%CO2培养箱中培养;细胞同步化:用2.5mM胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine,TdR)及5.5Kg/cm~2压力的N_2O将细胞同步化并将细胞分成两组:Ⅰ.紫龙金组:同步过程中的人胃癌BGC—823细胞,于第二次TdR释放后3小时更换含0.5mg紫龙金/ml的15%胎牛血清的DMEM培养液培养;Ⅱ.对照组:仅更换含15%胎牛血清的DMEM培养液培养;37℃、5%CO2培养箱中继续培养7小时;流式细胞仪 检测细胞同步效果并观察紫龙金对G2期有否阻滞作用;计算有丝分裂指数以进 一步区分G2、M期细胞的百分比;基因芯片检测:包括抽提人胃癌BGC一823细 胞total RNA、CDNA探针合成、cDNA探针与基因芯片杂交、将基因芯片置于磷 屏上显影、用Array Gauge VI .0软件分析基因芯片结果。 3.部分差异基因(eyelin EZ,p16)的分析: 选出cyclin EZ、pl6基因进行分析:1 .RT一PCR验证:将Total RNA中的 mRNA逆转录成cDNA后进行PCR反应,并用e一aCtin基因做内参照,检测基因 的mRNA表达水平,并将之与基因芯片结果作比较;H .Western b10t检测差异 基因的蛋白质表达水平:提取细胞蛋白,进行蛋白浓度测定,并依次在丙烯酞胺 凝胶上分离蛋白质、转膜、封闭、加一抗、辣根酶标记的二抗、加显色发光底物、 压片、显影、定影,并用日一actin蛋白做内参照,ChemilmagerT肠5500灰度扫描 仪测蛋白条带亮度。 人胃癌BGC一823细胞P16反义封闭实验:封闭P16 mRNA起始密码子及终止 密码子的寡核普酸各一条,合成时进行全程硫代修饰,封闭后用western一blot 检测其对P16蛋白的影响,用日一aC t in蛋白做内参照并用流式细胞术检测细胞 周期的变化。 4.紫龙金对人胃癌BGC一823细胞侵袭力的影响: (1) Matrigel体外侵袭实验观察紫龙金对人胃癌BGC一823细胞侵袭力的影响。 ICAM一基因的影响: (2)RT一PCR及Western blot分析ICAM一1基因:(方法与上述相同)。 (3)免疫荧光(间接法)检测紫龙金对人胃癌BGC一823细胞ICAM一蛋白分布的 影响:细胞培养,并分别在对照组、紫龙金组细胞中加入一抗、F工TC标记的二 抗,用甘油:PBS(9:l,pHS.5)封片,荧光显微镜下观察、照相。 一本文主要结果如下: 1.紫龙金对人胃癌BGC一823细胞生长、增殖的影响: (l)生长曲线绘制:发现紫龙金、HMBA能明显抑制人胃癌BGC一823细胞增长, 紫龙金抑制效果较HMBA略强。 (2)软琼脂集落形成实验:发现紫龙金能明显抑制人胃癌BGC一823细胞的集落 形成。 2.基因芯片检测紫龙金对人胃癌BGC一823细胞基因差异表达: 在1176个基因中,用药后升高5.0一9.9倍者18个、10倍以上者9个,降 低5.0一9.9倍者39个、10倍以上者17个。此外,发现紫龙金对人胃癌BGC一823 细胞GZ期有阻滞作用。 3.部分差异基因(eyelin EZ,p16)的分析: 紫龙金组的cyd inEZ基因、pl6基因的mRNA水平较对照组高,紫龙金组 中两种基因的蛋白水平亦较对照组高。 人胃癌BGC一823细胞P16基因反义封闭实验:与对照组相比,反义封闭后 Gl期细胞百分比减少。 4.紫龙金对人胃癌BGC一823细胞侵袭力的影响: (1) Matrigel体外侵袭实验发现紫龙金能使穿透聚碳酸酷膜的人胃癌BGC一823 细胞数量明显减少。 (2)紫龙金组的ICAM一l基因的tnRNA水平较对照组低,其蛋白水平亦较对照组低。 (3)免疫荧光(间接法)检测显示紫龙金能使人胃癌BGC一823细胞ICAM吐蛋白 的荧光信号基本消失。 三.本文得出以下结论: 1.紫龙金能明显抑制人胃癌BGC一823细胞增长; 2.对人胃癌BGC一823细胞GZ期具有显著阻滞作用: 3.能提高人胃癌BGC一823细胞CyClinEZ、P16基因的mRNA及其蛋白水平; 4.明显抑制人胃癌BGC一823细胞侵袭力; 5.降低人胃癌BGC一823细胞ICAM几基因的mRNA及其蛋白水平; 6.研究中发现的众多差异基因,为今后的科研工作提供有益的线索。


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