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唐氏综合征的基因诊断及其无创性产前基因诊断的初步研究

陈振斌  
【摘要】: 唐氏综合征(Down Syndrome,Ds,又称先天愚型或21三体综合征)是—种最常见的先天性染色体数目畸形,发病率高达0.12%。目前该病的诊断是通过羊水穿刺、绒毛膜活检或脐静脉穿刺术获取胎儿细胞,经培养后进行染色体核型分析。它存在以下缺点:1、羊水细胞培养难度大,周期长(2周多),不易得到普及而影响产前诊断的开展。2、羊水穿刺等技术是有创性检查,可导致1%的胎儿流产率,故不易被孕妇所接受而漏诊。由于上述原因的影响,我国每年约有25000个DS患儿出生,给家庭和社会带来严重经济负担,并降低国民的人口素质。故迫切需要一种对孕妇无创伤,对胎儿无风险,且能准确快速简便地进行DS诊断的新方法。 短串联重复序列(STR)广泛分布人类基因组中,具有操作简便,分型准确和丰富的多态信息量等特点而成为第二代DNA分析技术的核心。STR位点基因型在正常二倍体胎儿中常表现为1:1的二条带图谱,而三体的胎儿常表现为1:1:1三体图谱或2:1双倍剂量图谱,3条带图谱是诊断三体的金标准,双倍剂量图谱为辅助诊断指标。故在21号染色体上DS关键区内选择10个STR位点(D21S11、D21S1432、D21S1413、D21S1414、D21S1446、D21S1437、D21S2039、D21S1270、D21S141 1、D21S1412),根据STR基因型的表现,可进行DS的基因诊断。由于不同民族具有不同的基因库,在应用STR位点进行基因诊断时,首先必须阐明该民族的STR结构分布特征。故在北京地区汉族人群中随机抽取200多例外周血对其中未知结构特征的9个STR位点进行PCR-STR分型。根据基因序列,设计1对引物,进行PCR反应,其产物经聚丙烯凝胶电泳和银染后与等位基因标准混合物对比,或运用基因片段扫描技术,确定各个样本的基因型,最后进行统计学处理。结果首次阐明了中国汉族人群该9个STR位点的结构分布符合Hardy-weinberg定律,具有较高的杂合度和丰富的多态信息量,证实为21号染色体的良好的遗传标记,为基因诊断、亲子鉴定等DNA分析技术提供理论和概率计算依据。 联合运用~匕违10个STR位点对23例可疑患者和26例DS筛查出高危孕妇的羊水 细胞进行DS的基因诊断。将10个STR位点的陀R产物用聚丙烯铣胺凝胶电泳和银染 法或基因片段扫描法幽神卸叮,结果从23例可疑患者中发现7例璐患者,其中6例 均出现三条带图谱,1例虽未发现3条带图谱,但除纯合子外其余位点均表现为双倍 剂量(2:1)的2条带图谱。26例胎少公准水细胞盯R基因型均表现为正常2条带图谱 (1:1),表明为非璐胎儿。将基因诊断结果与染色体核型分析结果对比,二者完全 一致‘但基因诊断仅需耗时2~3天,操作简便,适宜推广应用。以上结果表明联合应 用10个STR位点司稚确、快速简便地进行璐产前基因诊断。国内少数单位曾仅根据 l~2个STR位点的基因型进行基因诊断声聪汰大。国外近几年来采用荧光陀R对1~ 4个STR位点基因型幽予分析,根据3条带或2:1的2条带图谱进往基因诊断。为此, 本文在国内首次建立了联合应用10个SIR位点的荧光陀R,几乎使所有的DS患者出 现3条带型而得到明确诊断。 近年来发现孕妇夕调血中存在微壕幼台少嘟胞,本文通过密度梯度离心获取有核血 细胸舌,应用磁激活细胞分选法富集纯化夕调血中的有核红细胞,Kl eihauer染色鉴 定出胎少断育核红细胞(刚砒犯),应用显微切害g技才彬瞰单个胎儿有核红细胞,进行单 细胞靶基因的预扩增和巢式咒R,最后应用基因片段扫描技术进行检测。靶基因的筛 选是应用唐氏综合症基因诊断中的10个位点,通过卜眺绷台少以姆涂基因型完全不同或 部分不同的盯R位点确定的,例如有3个,这样对刚班犯进行分析时就只作这3个STR 位点的分析,同时也可进一步断定有核红细胞的来源。应用上述方法对20例DS筛查 阳性的孕妇夕调血的胎少嘟胞幽于DS基因诊断,结果均成功分离出脚七有核红细胞, 12例单细胞陀R成功扩增出靶基因片段,结果为非21三体胎儿。其结果与临床细胞 遗传学检查一致,初步表明运用此策略可成功训称陇d性产前DS的基因诊断。无创性 产前DS的单细胞基因诊断国内外未仄甘团道,偶见国夕游7一O个胎儿有核幻细胞混合 在洲起进行天沧d性产前DS基因诊断,但有母喇翻台少断育核乡闯胞污染的可能。本研究 策略在国内外尚属首见,有待于进一步深入研究。 孕妇外周血中除胎少图胞外,其血浆中还存在微量游离的胎儿侧A,是天沧!胜产 前基因诊断的另一重要材料来源。对73例孕妇夕调血浆通过柱分离提取血桨总侧A 后,应用巢式代R进布到治儿性别决定基因(SRY)的扩增,其灵敏度为97.36%,特异 性85.71%,总符合率91 .7少y0(6认勺3)。表明应用孕妇夕调血游翻台儿洲A可进布孙咙d 性产前性别鉴定,有助于性连锁遗传病高危胎儿的早期性拐lJ诊断。 总之,本辛首次阐明了21号染色体上9个弧位点在中国汉族人群中的杂合频 率和多态信息含量,并建立了准确、快速、简便的璐产前基因诊断方注拜口无创性产前 性别基因诊断方法,可及时进行DS的产前诊断和性别鉴定,从而有效预防DS和性连 锁遗传病的患儿出生,具有明显的经济效益和社会效益。本文采用新策略初步对DS 进行无创性产前基因诊


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