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蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)抗黑色素瘤细胞侵袭与转移的作用

万榕  
【摘要】:cystatin是半胱氨酸蛋白酶内源性高效可逆性抑制剂,已有资料表明cystatin的表达失调与肿瘤的侵袭与转移密切相关。蛇毒cystatin(sv-cystatin)是从眼镜蛇蛇毒中分离纯化的一种小分子蛋白质,其结构与Ⅱ型cystatin(如cystatinM)相类似,提示sv-cystatin有抗肿瘤侵袭与转移的潜能。为了进一步探讨sv-cystatin抗肿瘤侵袭与转移的作用,本研究应用毕赤酵母表达系统生产重组的sv-cystatin和应用基因转染技术建立sv-cystatin稳定转染的B16F1细胞株,探讨sv-cystatin抗B16F1细胞的侵袭与转移作用。获得如下结果: 一、sv-cystatin基因的合成 应用基因重组技术,根据蛇毒cystatin蛋白氨基酸序列,选用酵母偏爱密码子,经缓慢退火PCR拼接扩增合成蛇毒cystatin基因并将其克隆至pUC18载体,获得pUC18-cystatin质粒,为生产重组sv-cystatin提供正确的目的基因。 二、sv-cystatin在巴斯德毕赤酵母系统中的表达及抗B16F1细胞侵袭与转移作用 构建毕赤酵母重组表达质粒pPICZα A-cystatin,电击法转化甲醇营养型酵母细胞GS115,通过PCR扩增和表型筛选获得阳性转化子GS115-cystatin;1%甲醇诱导培养后,Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot分析表明蛇毒cystatin在毕赤酵母中能有效分泌表达,表达产物分子量约为14KD左右,凝胶扫描分析显示重组sv-cystatin蛋白的表达量占总蛋白的11.4%,产量约16 mg/L。利用ProBond蛋白纯化系统对重组sv-cystatin蛋白进行纯化,每升发酵液可获得


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