催乳素免疫调节效应的研究及其信号传导途径的蛋白质组分析

【摘要】： 目的:为探讨催乳素/催乳素受体(PRL/PRLr)介导的免疫应答机制,本课题研究PRL对免疫应答基本过程的影响并对信号传导途径进行了整体性分析,前者进行三方面试验,既分别测试催乳素刺激前后T细胞活化所需第二信号共刺激因子CD154和CD28水平、细胞增殖能力及其免疫效应分子IFN-γ/IL-4分泌模式,后者通过蛋白组学分析,试图了解催乳素在免疫细胞中的信号网络系统。 方法:实验一应用不同剂量的重组人催乳素(rhPRL)和植物血凝素(PHA)单独或联合刺激人T淋巴白血病细胞株JurkatD1.1细胞,利用流式细胞仪检测细胞表面CD154和CD28分子的表达量;对不同时间点JurkatD1.1细胞表面CD154和CD28分子的表达量进行测定。应用催乳素受体单克隆抗体(PRLrAb)阻断催乳素的作用,分别比较JurkatD1.1细胞表面CD154和CD28分子基础表达量和rhPRL联合PHA刺激组表达量在应用PRLrAb前后其各自呈现的变化。同时应用半定量RT-PCR测定对照组、rhPRL联合PHA刺激组和PRLrAb阻断组JurkatD1.1细胞表面CD154和CD28分子mRNA的表达水平。实验二应用台盼蓝拒染法通过倒置显微镜进行细胞计数以及利用MMT比色法酶标仪测定OD550值来评估rhPRL对JurkatD1.1细胞增殖的影响。实验三应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测不同浓度rhPRL刺激JurkatD1.1细胞24小时后的细胞上清液中IFN-γ和IL-4水平,并计算IFN-γ/IL-4比值,籍此来反映Th1/Th2细胞因子平衡偏离的方向。实验四应用磷酸化金属亲和层析法(PMAC)富集磷酸化蛋白并用单向凝胶电泳(1DE)分离,同时利用抗磷酸化酪氨酸抗体免疫沉淀法(IP)富集磷酸化酪氨酸,并用双向凝胶电泳(2DE)分离。染色后通过凝胶扫描系统对不同组的蛋白质斑点或条带进行分析,应用手工和自动挖胶系统获取差异的蛋白质斑点或条带。酶解后通过质谱分析并与蛋白质数据库进行蛋白质匹配鉴定,由此鉴定出参与催乳素在JurkatD1.1细胞内信号传导的信号分子。 结果:单独使用重组人催乳素(rhPRL)或者植物血凝素(PHA)并不能刺激