慢病毒载体介导Bdnf基因修饰的大鼠骨髓间质干细胞移植治疗脑梗死
【摘要】：
第一部分Bdnf基因修饰的大鼠骨髓间质干细胞获取及鉴定
目的构建带有大鼠Bdnf基因之慢病毒载体,并感染大鼠骨髓间质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)后,进一步检测BDNF表达从而获得有生物活性Bdnf修饰的rMSCs(Bdnf-rMSCs)。
方法提取大鼠海马总RNA,通过RT-PCR技术获得大鼠Bdnf基因编码区(CDS)片段,构建慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。提取新鲜骨髓,体外分离rMSCs并培养、鉴定。浓缩病毒测定滴度后感染2-4代rMSCs,荧光激发及细胞化学及RT-PCR以鉴定。
结果Bdnf基因测序结果与Genbank报道序列完全一致。构建的慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP经Sal I和BamH I双酶切鉴定正确,三质粒共转染293T细胞后荧光激发可见大量绿色荧光。收集、浓缩病毒后测定滴度为6.7×107 TU/ ml,提取病毒基因组经PCR证实Bdnf基因插入。感染rMSCs后荧光激发可见绿色荧光, RT-PCR检测示Bdnf-rMSCs组BDNF mRNA水平表达较空载体-rMSCs组及rMSCs组高,细胞化学检测有BDNF蛋白表达。
结论成功构建带有Bdnf基因之慢病毒载体,并借此获得Bdnf-rMSCs基因工程干细胞,该细胞可大量表达BDNF蛋白,为下一步Bdnf-rMSCs移植治疗脑缺血损伤奠定了基础。
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