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慢病毒载体介导血管生成素-1基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死的实验研究

陈柏龄  
【摘要】: 脑梗死是人类致死的三大疾病之一,其高致残性给患者、家庭和社会带来沉重的负担。长期以来,人们认为中枢神经损伤后引起神经细胞不可逆的死亡,损伤的神经元只能被胶质细胞所填充,形成胶质疤痕,从而丧失了神经功能。近年来,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植治疗脑梗死已成为研究热点。MSCs作为种子细胞,在体内可向多种急性损伤后的组织迁移并定位,在局部微环境的调控下分化为不同的组织细胞。MSCs为组织结构和功能修复提供了细胞来源,且易通过血-脑屏障,少有免疫排斥反应,已成为脑缺血性疾病治疗的理想靶细胞。血管生成素-1 ( Angiopoietin-1,Ang-1)是一类重要的血管生长因子,特异性地作用于内皮细胞,参与血管生成的调控过程,Ang-1通过干预内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞之间的相互作用促进血管生成和重塑,在缺血等病理状态下可作为一种关键的血管生成调节剂。它可通过促进缺血组织周围侧支循环形成、稳定血管、延缓血管退化;加强内皮细胞间的紧密连结,维持血脑屏障的完整性;保护神经元、抑制凋亡等多重作用机制,从而明显增加缺血脑组织血流灌注,挽救半暗带神经元。Ang-1已成为缺血性脑血管病基因治疗新的靶点。慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗中载体研究的热点。因此,我们设想通过慢病毒载体的介导,将Ang-1基因转移至MSCs中,并将基因修饰的MSCs通过静脉移植至大脑中动脉栓塞模型大鼠中,利用MSCs可向急性损伤病灶趋化聚集的特点,期待MSCs能够携带Ang-1基因迁移至损伤部位,发挥Ang-1和MSCs的协同治疗作用。本课题分为三部分。 第一部分:血管生成素-1基因重组慢病毒载体质粒的构建及鉴定 从Genbank获得Ang-1基因序列,结合载体上的酶切位点需要,设计上下游引物,通过RT-PCR方法扩增目的基因片段,通过TA克隆筛选正确的重组体,再通过双酶切和基因重组构建Ang-1重组慢病毒载体质粒pNL-Ang-IRES2-EGFP,经抗生素筛选后,进行酶切鉴定和测序。结果显示我们获得长度为1512bp的Ang-1目的基因片段,质粒pNL-Ang-IRES2-EGFP经双酶切后凝胶电泳鉴定正确,测序结果与Genbank报道序列一致。 第二部分:构建血管生成素-1基因修饰的骨髓间充质干细胞 首先通过密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法在体外提取、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs),并经流式细胞学检测各代CD29、CD34、CD45的表达情况。通过脂质体介导慢病毒三质粒pNL-Ang-IRES2-EGFP(或pNL-IRES2-EGFP,做为空载体对照)、pVSVG、pHELPER共转染293T细胞,收集病毒上清进行超速离心浓缩。PCR检测病毒基因组中目的基因Ang-1的插入。将病毒上清感染rMSCs,通过荧光显微镜观察目的基因的表达,细胞RT-PCR检测Ang-1的mRNA表达,细胞免疫化学和Western blot检测Ang-1蛋白的表达情况。然后通过鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)血管形成实验和内皮细胞条件培养检测所表达Ang-1蛋白的生物学活性。结果显示我们通过密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法获得了比较纯的rMSCs,慢病毒感染后Ang-1可整合至rMSCs基因组中,并可正确转录和表达,所表达的Ang-1蛋白具有促进血管生长的生物学活性。 第三部分:血管生成素-1基因修饰的骨髓间充质干细胞静脉移植对脑梗死的疗效及其迁移、分化的观察 线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,通过体征的观察和TTC染色验证模型的成功与否。然后通过股静脉移植基因修饰的rMSCs,通过modified Neurological Severity Scores(mNSS)评分法进行大鼠行为学观察,脑片HE染色观察组织学变化。利用载体自带的EGFP报告基因,在荧光显微镜下观察移植细胞的迁移和分布,并通过NF200、GFAP、NSE抗体的免疫荧光染色观察移植细胞在脑中的分化情况。结果显示,线栓法建立的大鼠MCAO模型稳定可靠,可很好地模拟人类急性脑缺血的病理生理变化。经rMSCs移植治疗的MCAO大鼠神经功能和组织学的恢复都好于对照组,而Ang-1和rMSCs联合治疗的MCAO大鼠神经功能和组织学观察则显示优于单纯rMSCs治疗组,证实了Ang-1和rMSCs的协同治疗作用。另外我们观察到移植的rMSCs可迁移定居至脑损伤部位,并且免疫荧光染色发现部分的rMSCs表达神经元的特异标志物NSE、NF、以及星形胶质细胞标志物GFAP,在移植3个月后仍可观察到此现象。以上结果说明了rMSCs可携带治疗基因至脑损伤部位,并长期存活,分化表达各种神经细胞标志物,很可能在脑缺血损伤后的恢复中发挥促进作用。


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