TGF-β_1及其异构体对HL-60细胞增殖的作用与机制研究

【摘要】： 转化生长因子-β(TGF-β)家族是一类结构相关、生物学活性相近的多肽。在造血调控方面,主要发挥负性调控作用,与正性细胞因子一起维持着造血细胞增殖和分化的平衡。在这个家族中有30多个成员,人体内只存在有TGF-β_1、TGF-β_2、TGF-β_3三种异构体,在调控细胞生长和分化方面具有不同的作用。TGF-β_1对白血病细胞有直接的抑制作用,而对于TGF-β_1的异构体—TGF -β_2、TGF -β_3对白血病细胞的作用研究国内外还未见报道。有关它们在白血病细胞中的表达情况未见系统报道。这三种异构体之间是否存在某种关联目前也尚不清楚。ATRA和ATO是我国学者发现的治疗急性早幼粒细胞白血病的有效药物。有关内源性细胞因子,特别是TGF-β_1是否参与了ATRA和ATO对白血病细胞的作用机制的报道也很少。 本研究内容分三部分: 1.以HL-60细胞为研究对象,应用生长曲线、MTT法、集落形成抑制试验、NBT还原试验、DNA ladder、流式细胞术等方法探讨TGF–β_1、TGF–β_2、TGF–β_3对白血病细胞分化和凋亡的影响;采用半定量RT-PCR方法研究这三种异构体对bcl-2、c-myc、fas、bax等凋亡相关基因表达的调控。 2.应用实时定量RT-PCR和ELISA方法研究白血病细胞及血细胞分化各阶段TGF-β_1及其异构体的表达及其意义; 3.构建针对不同靶位点的TGF-β_1 RNAi质粒,应用实时定量RT-PCR和ELISA方法鉴定基因沉寂效果及TGF-β_1表达被抑制后其异构体表达的变化。应用NBT还原试验、流式细胞术等方法研究ATRA、ATO对采用siRNA方法抑制TGF-β_1表达的HL-60细胞的作用。 取得了以下主要结果及结论: 1. TGF–β_1、TGF–β_2、TGF–β_3对HL-60细胞的增殖均有抑制作用,这种抑制作用具有剂量依赖性,其中TGF–β_1的抑制作用最强。在低浓度下,TGF–β_1可诱导HL-60细胞出现分化,而TGF–β_2、TGF–β_3诱导分化的作用不如前两者明显。在高浓度下,三者均可诱导HL-60细胞出现一定程度的凋亡,也以TGF–β_1的作用最明显。它们可能通过调控凋亡相关基因来诱导HL-60细胞凋亡。对凋亡相关基因表达的调控程度不同可能是这三种异构体对HL-60细胞的抑制作用强度不同的原因之一。 2. CD_(34)~+细胞、BMNC、PLT、AL细胞、CML细胞均表达TGF–β_1、TGF-β_2、TGF-β_3,其中越是成熟的细胞,TGF-β_1的表达水平越高;提示内源性TGF-β_1在血细胞的成熟分化过程中可能起着重要的作用,其表达水平的降低在白血病的发病机制中起重要作用。TGF-β_2、TGF-β_3的表达水平在正常血细胞中的表达没有这种趋势,提示TGF-β_2、TGF-β_3在正常血细胞成熟分化过程中表现不活跃。CML细胞的TGF-β_1、TGF-β_2及TGF-β_3表达比CD_(34)~+细胞明显降低,提示内源性TGF-β_2、TGF-β_3的表达下降也可能在CML发病的机制中起一定的作用。 3.成功构建针对不同靶位点的TGF-β_1的干扰表达质粒,其中针对起始编码区的干扰质粒的抑制效率最高,对HL-60细胞TGF-β_1蛋白的抑制率为73.2%。 4.用RNAi技术使HL-60细胞中TGF-β_1基因表达下调时,TGF-β_2及β_3的表达并未明显增高。内源性TGF-β_1基因水平下降后,ATRA和ATO对白血病细胞的作用有所减弱,提示内源性TGF-β_1可能参与了ATRA和ATO对白血病细胞的作用。 本课题为研究自分泌因子在血细胞分化、凋亡过程中的作用提供了理论及实验基础,并对ATRA和ATO的作用机制进行了有益的探索。