乙型肝炎病毒在非酒精脂肪肝发生中的作用及机制研究

【摘要】： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。全球约20亿人被证明有HBV感染,其中3.5亿人为HBV慢性感染,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。近年来由于非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发病率逐年增加,导致肝细胞脂肪变与慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B,CHB)在同一个体中合并存在的病例明显增多,对两者相关性的研究逐渐受到重视。但迄今为止,HBV与非酒精性脂肪肝的关系尚未明确。流行病学调查显示CHB患者肝脂肪变的患病率相差很大(3%~76%),已有多项研究表明HBV与脂肪肝联系密切,且为脂肪肝的危险因素。但另有研究表明CHB患者肝细胞脂肪变的发生主要与宿主的代谢因素相关(如年龄、肥胖、血脂水平和代谢综合征等因素),而与病毒因素(如HBeAg和HBV-DNA载量等)关系不密切。因此HBV与脂肪肝的关系有待于进一步的研究。此次研究从群体和细胞两个角度探讨HBV与肝细胞脂肪变的关系及其可能的作用机制,并确定与肝细胞脂肪变有关的HBV编码蛋白。该研究结果不仅有助于判断HBV感染者患非酒精性脂肪肝的风险,加深人们对HBV致病机制的认识,更为有效地进行脂肪肝的防治提供理论基础,这对HBV高发国家具有特别重要的现实意义。 一、HBV感染与非酒精性脂肪肝关系的病例对照研究 采用病例对照研究方法,应用多因素统计学分析法控制混杂因素的影响,探讨HBV感染血清标志物、感染模式、HBV-DNA载量及病毒与宿主因素的交互作用与非酒精性脂肪肝的关系。研究结果显示:NAFLD组中HBV总感染率(84.16%)高于对照组(69.21%)(P0.05),控制混杂因素影响后,HBV感染者发生NAFLD的风险(OR)为3.15(95%CI:1.18~5.50);在10种感染模式,有六种感染模式与NAFLD发生密切相关,其中HBsAg、Anti-HBe、Anti-HBc三项均阳性的感染模式患NAFLD的危险性最高,OR为6.47(95%CI: 2.90~14.44);其次分别为感染模式6(HBsAg、Anti-HBc二项阳性)、模式7(Anti-HBs、Anti-HBc二项阳性)、模式5(Anti-HBs、Anti-HBe、Anti-HBc三项阳性)、模式4(Anti-HBe、Anti-HBc二项阳性)和模式3(Anti-HBc单项阳性)的危险性相对较高;HBV感染与HDL-C异常存在协同致非酒精性脂肪肝的作用(P交互作用=0.034);没发现HBV-DNA检出率及平均滴度与非酒精性脂肪肝存在关联。 二、乙型肝炎病毒对脂类代谢相关蛋白的影响 根据已有的蛋白质组学研究结果,在HBV肝细胞系模型(pREP-HBV)的基础,结合瞬时转染的方法,从蛋白和mRNA水平进一步验证HBV对脂类代谢相关蛋白,包括载脂蛋白AI(apolipoprotein A-I,APOA1),载脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE),锰超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 2 ,SOD2),依赖还原型辅酶I/II:醌氧化还原酶(NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1,NQO1),肝型脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein 1,FABP1)和酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶2(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2,ACAT2)的影响。研究结果显示:与对照细胞株相比,RHBV-3细胞株中ApoAI、APOE、SOD2和NQO1基因的蛋白和转录水平表达下调,FABP1基因蛋白和转录水平表达上调,变化趋势与蛋白质组结果一致,ACAT2表达没明显变化。为了进一步验证HBV对脂类代谢相关蛋白的影响,将含HBV全基因组的重组质粒pRep-HBV和对照质粒pRepsal分别转染HepG2、Huh7和YY细胞。结果显示,HBV对HepG2、Huh7和YY细胞SOD2、NQO1和FABP1三个基因的蛋白和转录水平均有影响,其中SOD2、NQO1基因的蛋白和转录水平表达下调,FABP1基因的蛋白和转录水平表达上调,变化趋势与蛋白质组结果一致;HBV可使HepG2细胞的ApoAI蛋白水平表达下调,但对ApoAI转录水平没有影响;HBV对HepG2、Huh7和YY细胞的ApoE和ACAT2基因蛋白表达水平均没有影响,但HBV可使三株细胞的ApoE基因转录水平表达下调及ACAT2基因转录表达水平上调,变化趋势与蛋白组学结果一致。比较细胞株和瞬时转染实验的分析结果,发现在上述六个脂类代谢相关蛋白中,SOD2,NQO1和FABP1瞬时转染实验分析结果与细胞株实验分析结果完全一致,且mRNA表达变化趋势与其翻译产物(蛋白质)表达变化趋势相同。上述研究结果表明HBV整体水平对脂类代谢相关蛋白表达具有影响,特别是对SOD2,NQO1和FABP1三个蛋白表达的影响尤为明显,该结果为HBV致肝细胞脂肪变作用机制的深入研究打下良好基础。 三、乙型肝炎病毒蛋白对SOD2,NQO1和FABP1表达的影响 应用AdEasy XL System构建HBV编码蛋白的重组腺病毒Ad-X、Ad-S、Ad-MS、Ad-LS、Ad-C、Ad-E、Ad-P和空病毒(Ad0),从蛋白和mRNA水平探讨HBV编码蛋白与特定宿主细胞中SOD2,NQO1和FABP1表达的对应关系。研究结果如下:成功构建可分别表达HBV X、CORE、E、S、MS、LS、P蛋白的重组腺病毒;与空病毒Ad0感染组相比,HBx可导致HepG2细胞SOD2和NQO1的转录和蛋白水平表达下调,FABP1的转录和蛋白水平表达上调;HBV主蛋白(S)可使HepG2细胞FABP1的转录和蛋白水平表达上调,SOD2和NQO1的转录水平下调;HBV中蛋白(MS)可使HepG2细胞SOD2的蛋白水平表达下调,但三个基因的转录水平没有明显变化;HBV大蛋白(LS)可使HepG2细胞FABP1蛋白表达水平上调,但三个基因转录水平均没有明显变化;HBV聚合酶(polymerase,P)蛋白对HepG2细胞三个基因的蛋白表达水平均没有明显影响,但可使SOD2和NQO1转录水平表达下调;HBV CORE蛋白对HepG2细胞三个基因的蛋白和转录水平均无影响;HBV E蛋白使HepG2细胞SOD2的蛋白和转录水平表达下调及NQO1转录水平表达下调。上述结果提示,在HBV 7个蛋白中,HBx蛋白及主蛋白对SOD2,NQO1和FABP1表达的影响尤其明显,因此,HBx和主蛋白可能在HBV相关的肝细胞脂肪变发生发展中起着重要作用。