骨桥蛋白特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及其在U251胶质瘤细胞中沉默效应的鉴定

【摘要】： 目的观察慢病毒表达载体介导的小干扰RNA对人神经胶质瘤细胞U251 OPN表达的影响,为后续的以OPN基因为靶点的神经胶质瘤基因治疗研究奠定基础。 方法应用基因工程技术,筛选出针对OPN基因的siRNA靶序列,与pGCL-GFP载体连接,构建重组慢病毒表达载体lentiviral -OPNshRNA,将连接产物转DH5α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定。将LV-OPNshRNA、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。将包装产生的重组慢病毒分别感染U251细胞,半定量PCR检测基因的表达,Western-blot方法鉴定蛋白表达;噻唑兰比色(MTT)法检测OPN受干扰后U251细胞的增值能力的影响;Transwell体外侵袭实验观察干扰后细胞侵袭能力的变化。 结果1.成功构建针对OPN基因的慢病毒干扰载体LV-OPN shRNA 2.慢病毒感染U251细胞后,OPN基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降。 3.在增殖实验中,慢病毒干扰载体LV-OPN shRNA细胞组的增殖能力与空载体对照组和未转染组相比有明显下降,差异有具有统计学意义。 4.在Transwell侵袭实验中,与空载体对照组和未转染组相比,慢病毒干扰载体LV-OPN shRNA细胞组体外侵袭能力明显下降,差异具有统计学意义。 结论通过RNA干扰方式特异性地沉默U251细胞OPN基因的表达。沉默U251细胞OPN表达后,U251细胞的增殖与转移能力均下降。本研究提示OPN基因的沉默措施可能成为临床治疗脑胶质瘤提供新的途径。