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检测慢性粒细胞白血病相关基因的DNA电化学探针筛选实验研究

王昆  
【摘要】: 电化学DNA生物传感器是近几年迅速发展起来的一种全新的生物传感器,具有灵敏度高、响应快、操作简便、微型化、价格低廉等优点,对临床医学和遗传工程的研究具有深远的意义和应用价值。核酸探针技术是随着基因工程技术发展而发展起来的一种前沿生物技术,具有专一性强、灵敏度高、快速准确等特点,在生物大分子研究、临床疾病诊断和治疗等方面发挥出巨大作用。 本文设计了两种新型的电化学探针(发夹结构探针和锁核酸),并分别构建了两种不同的电化学DNA传感器,用于慢粒白血病BCR/ABL融合基因的检测,同时考察了传感器的特异性、稳定性等性能。 首先,根据CML融合基因的碱基序列设计了发夹结构DNA探针(hairpin probe, HP),应用CV法在电极表面修饰上对氨基苯磺酸(4-ABSA),并通过设计带有氨基修饰的探针与4-ABSA膜的磺酸基共价键合形成磺酰胺键,使探针牢固地连接于电极表面,并且以亚甲基蓝(MB)作为杂交指示剂,构建出的电化学DNA生物传感器可以识别和定量检测溶液中人工合成的短链BCR/ABL融合基因片断。经过条件优化,测定DNA的浓度线性范围为8.0×10-11 ~ 4.0×10-10 mol/L,检测限为7.9×10-12 mol/L,且在一定的实验条件下,该传感器能较好地区分杂交溶液中的互补序列,单碱基错配和完全非互补序列,可以实现对CML中BCR/ABL基因定性定量的测定。 此外,将锁核酸(locked nucleic acid, LNA)探针与电化学酶联免疫分析技术相结合构建了锁核酸修饰的三明治型电化学DNA生物传感器对目的基因进行检测,通过杂交前后电流的变化作为指示信号。结果表明:在优化杂交条件下,该传感器测定DNA的浓度线性范围为1.0×10 -14~2.5×10–13 mol/L,检测限为5.0×10-15 mol/L。能很好的识别杂交溶液中的完全互补序列与单碱基突变序列,可以实现对CML中BCR/ABL基因定性定量的测定。 最后,本文开展CML实际样品的初步实验研究,进行了临床实际样品的检测,以病人血样的cDNA为模板,通过设计的引物扩增得到PCR产物,凝胶电泳后,将回收的胶片段进行测序分析,确定了与目标DNA完全互补的特异性探针序列,并对其进行电化学检测,与凝胶电泳结果进行比较,为实际样品的进一步检测研究提供了良好的基础。


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