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Hes1和Hes5表达与人神经胶质瘤细胞增殖能力相关性的研究

王春华  
【摘要】: 目的: 1、探讨Notch1受体和其下游信号分子Hes1、Hes5在神经胶质瘤中表达特点和相互关系; 2、构建Hes1、Hes5基因RNAi慢病毒载体,筛选获得Hes1、Hes5沉默的神经胶质瘤细胞株; 3、观察Hes1、Hes5基因沉默对神经胶质细胞U251增殖的影响,初步探讨Notch-Hes信号通路调控神经胶质瘤增殖的可能机制。 方法: 1、应用免疫组织化学方法检测人脑星形细胞瘤和正常人脑组织中Notch1和Hes1、Hes5表达情况; 2、设计、合成针对靶基因Hes1、Hes5的shRNA编码序列,将其克隆到pENTR /U6 RNAi入门载体,经瞬时转染筛选获得有效的靶序列。将含有Hes1、Hes5有效干扰序列的入门载体与pLenti6/BLOCK-iT?-DEST目的载体通过Gateway LR重组构建出相应的shRNA慢病毒表达载体,经293FT细胞包装获得慢病毒颗粒。通过慢病毒转导U251细胞后,筛选获得Hes1、Hes5基因沉默的U251细胞株; 3、采用MTT法,平板克隆形成实验,流式细胞术检测Hes1、Hes5基因沉默对U251细胞增殖及细胞周期的影响。 结果: 1、人脑星形细胞瘤中Notch1、Hes1和Hes5的表达均显著强于正常脑组织;在不同病理分级的星形细胞瘤中,Ⅱ~Ⅲ级组Notch1和Hes1的表达水平显著高于Ⅳ级星形细胞瘤组,Hes5的表达在两组间无显著性差异。星形细胞瘤中Notch1与Hes1的表达有较好的一致性,与Hes5的表达一致性较差。 2、成功筛选出Hes1、Hes5基因特异、有效的RNA干扰靶点,构建了针对Hes1、Hes5基因特异性shRNA慢病毒表达载体,并在293FT细胞中包装获得慢病毒颗粒,病毒滴度分别为8.4×104TU/ml、7.2×104TU/ml。 3、建立了Hes1、Hes5基因稳定沉默的神经胶质瘤U251细胞株。 4、沉默Hes1或Hes5均能明显抑制U251细胞增殖及克隆形成能力。 结论: 1、Notch1表达与星形细胞瘤的发生有关,与星形细胞瘤的病理分级无关。Notch1可能主要是通过下游分子Hes1而非Hes5发挥作用。 2、构建的Hes1、Hes5特异性RNAi慢病毒表达载体能有效抑制胶质瘤细胞U251中Hes1、Hes5基因的表达,可作为研究Notch-Hes信号通路及其与胶质瘤关系的重要技术手段。 3、Hes1、Hes5与胶质瘤细胞的增殖密切相关,在体外Hes1、Hes5特异性RNAi能够抑制胶质瘤细胞U251的增殖能力。


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