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建立实时荧光定量PCR检测新型隐球菌CAP10基因及临床初步应用

林旎  
【摘要】: 目的 建立实时荧光定量PCR(real-time Fluorescent Quantitative PCR,FQ-PCR)系统,定量检测新型隐球菌(Cryptococcus neoformans,CN)荚膜相关蛋白10(Capsule associated protein,CAP10)基因mRNA表达量及其变化,为将其应用于新型隐球菌感染的诊断和疗效判断奠定基础。 方法 根据新型隐球菌5种血清型(A、B、C、D、AD)中同源序列设计引物和探针, PCR扩增CAP10基因片段,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上,构建质粒标准品;建立FQ-PCR体系,优化反应条件,建立标准曲线,进行敏感性、特异性、重复性试验;检测23例新型隐球菌性脑膜炎患者抗真菌药物治疗前后脑脊液(CSF)中隐球菌的CAP10mRNA含量并结合临床和其他实验室资料进行分析。用SPSS10.0统计软件对结果进行统计学分析。 结果 1. FQ-PCR系统用于检测CAP10基因片段,灵敏度为101拷贝数/μl;批内变异系数(CV)为0.31%,批间CV为2.72%,重复性好;对临床其他常见脑膜炎病原体不出现特异性扩增曲线,特异性好。 2.好转组CAP10mRNA拷贝数治疗前、后CAP10 mRNA拷贝数(log10值)分别为1.28、0.75(n=20,P0.05),有显著性差异。CAP10 mRNA拷贝数与隐球菌总量呈正相关(r=0.446,P0.05),与颅内压呈正相关(r=0.671,P0.05),与白细胞计数无关(r=0.173,P0.05)。两性霉素与5-氟胞嘧啶联用组治疗前、后CAP10 mRNA拷贝数(log10值)分别为3.43、2.35(n=11,P0.05),有显著差异;大扶康与5-氟胞嘧啶联用组治疗前、后CAP10 mRNA拷贝数(log10值)分别为2.65、1.84(n=12,P0.05),有显著差异;两药物组治疗后CAP10 mRNA拷贝数的下降量分别为1.07、1.06,P0.05,无显著差异。 结论成功建立了新型隐球菌CAP10基因FQ-PCR检测方法,结果稳定、准确,初步提示该系统可用于CN的诊断和疗效判断。


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