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亚甲兰光化学法灭活血浆乙肝病毒及对红细胞膜的损伤研究

李秀娟  
【摘要】: 目的:研究不同浓度的MB(1.0μmol/L, 5.0μmol/L, 10.0μmol/L),在光照度为40000LUX,分别荧光照射血浆0、20、40、60min,灭活血浆病毒DNA,通过荧光定量PCR技术对血浆病毒灭活的各个不同时间段乙肝病毒DNA浓度进行监测,判断灭活效果,选定最佳灭活条件,并观察病毒灭活后对血浆成分的影响。研究5.0μmol/L的MB浓度,在光照度为40000LUX,分别照射红细胞悬液0、20、40、60min,观察MB法处理悬液的同时膜的损伤程度,间接了解对红细胞生物学功能的影响,探讨亚甲蓝光化学法在红细胞制品病毒灭活方面的可行性。 方法:在已知HBV-DNA阳性血浆中加入MB ,调整MB终浓度分别为1.0μmol/l、5.0μmol/l、10.0μmol/l ,光照度为40000LUX,照射时间分别为0min、20min、40min、60 min,在各点分别取样抽提基因组DNA用于荧光定量分析,测定HBV-DNA的浓度,推断在不同时间和浓度下的灭活效果。在灭活效果最好的点取样检测血浆正常成分有无显著变化,其中包括生化指标,酶学指标,凝血因子FⅧ:C活性,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳观察蛋白亚基的变化,蛋白免疫印迹观察血浆的抗体蛋白活性变化。同样方法,亚甲蓝光化学法处理红细胞悬液,光照度为40000LUX,MB浓度为5.0μmol/L,在光照0min、20min、40min、60 min后的不同时间点提膜测定红细胞膜Na+-K+ATP酶,膜AchE活性,并观察红细胞形态的变化及膜的通透性改变。 结果:当MB为10.0μmol/L,光照60min时,灭活乙肝病毒的效果最好,对于高拷贝数的病毒浓度,在本实验的条件下,尚无法完全灭活病毒,但可以使HBV-DNA浓度明显下降;从病毒灭活的表格看,灭活效果与时间和MB浓度呈正相关,作用60min时血浆中主要成分的生化指标无显著变化及凝血因子FⅧ:C活性无明显改变,部分血浆酶活性有明显下降(P 0.05)。血浆蛋白的亚基数目和迁移速度未见明显变化,血浆的抗体蛋白也具有正常的生物学活性。在用于红细胞制品灭活方面,亚甲蓝法还有缺陷,对红细胞膜的损伤较明显。随着照射时间的延长,红细胞的边缘出现了不规则、粘连,附着物也逐渐增多。红细胞的溶血度显著增大(P 0.05),几乎呈线性。在照射过程中,Na+-K+ATP酶无明显下降。膜AchE在40min后下降速率增大,与对照组比,下降了大约65%(P0.05)。在照射20min后渗透脆性也渐出现明显升高(P0.05)。推测亚甲蓝对膜损伤的主要机制可能是单线态氧和自由基的氧化作用。 结论:MB10μmol/L辅助荧光光照60min可使血浆中乙肝病毒量明显降低,但无法完全灭活。在此实验条件下,血浆的大多数成分能保持较高活性。MB法对红细胞膜有损伤作用,其损伤的机制可能是由于单线态氧和自由基对膜的过氧化作用。


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