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siRNA表达载体介导的RNA干扰抑制新型隐球菌cap10基因的表达

苏晓霁  
【摘要】: 目的: 构建针对新型隐球菌cap10基因的siRNA表达载体质粒,并转入新型隐球菌中,评价siRNA表达载体质粒对新型隐球菌(Cryptococcus neoformans,CN)荚膜相关蛋白(capsule associated protein,CAP)基因cap10表达的抑制效应,为新型隐球菌感染的治疗奠定基础。 方法: 以cap10基因为靶基因,根据GenBank数据库提供的cap10基因核苷酸序列,按照干扰模板设计原则,应用网络在线软件确定一个针对cap10 mRNA的RNAi(RNA inteference,RNAi)靶点,设计1对可形成发夹结构的核苷酸序列,将其复性后插入载体质粒psilencer4.1-CMV neo,构建重组体。用LiAc化学法将重组质粒转染新型隐球菌细胞,确定G418筛选的浓度并筛选成功转染的阳性菌株。构建cap10基因表达荧光定量PCR检测体系:比对新型隐球菌5种血清型(A、B、C、D、AD)的cap10基因序列,找出同源序列来设计引物和探针,并将其PCR扩增基因片段克隆到pGEM-T Easy载体上,构建质粒标准品;建立FQ-PCR体系,优化反应条件,建立标准曲线,进行敏感性、特异性、重复性试验;将各组新型隐球菌培养后抽提总RNA,利用荧光定量检测体系分别测定各实验组cap10基因的表达情况。取培养后的新型隐球菌与巨噬细胞标准株J774A.1进行共孵育,经过PBS冲洗和甲醇固定,用吉姆萨染液对细胞进行染色,在显微镜下观察,计算吞噬率和吞噬指数。用SPSS13.0统计软件对结果进行统计学分析。 结果: 1.靶向cap10基因的siRNA表达载体质粒的测序结果与设计序列一致; 2.抽提新型隐球菌阳性克隆中的质粒,序列测序结果与设计序列完全相同。 3.cap10基因表达的荧光定量检测体系检测敏感度为104copies/μl,线性范围为10~4~10~(10) copies/μl,批内CV为0.31%,批间CV为2.73%。 4.pS4.1-siRC-1转染干扰组新型隐球菌的cap10基因表达平均拷贝数为175534.62copies/μl,明显低于对照实验组(321995.52copies/μl)和空白实验组(562931.66copies/μl)(均P0.05),平均抑制率为30.58%。 5.新型隐球菌与巨噬细胞株J774A.1共孵育后,pS4.1-siRC-1转染干扰组平均吞噬指数为0.128971212 ,吞噬率为10.06%,明显均高于对照实验组(0.078898104,6.57%)和空白实验组(0,0%)(均P0.05)。 结论: 1.成功构建了针对cap10基因siRNA表达载体。 2.成功获得稳定转入的siRNA表达载体的新型隐球菌阳性株。 3.构建的荧光定量体系稳定、准确,敏感性为10~4拷贝数/μl,重复性好,特异性好,可以用于cap10基因表达的定量检测。 4.构建表达的siRNA成功抑制cap10基因表达,导致新型隐球菌逃避巨噬细胞吞噬的能力下降。


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