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RNAi沉默Notch1、Notch2对人胶质瘤U251细胞增殖的影响及其机制

张明芳  
【摘要】: 神经胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,高级别胶质瘤的预后通常很差,因此,探讨胶质瘤的分子机制,研究新的靶向治疗手段就显得十分重要。Notch信号是胶质瘤发病机制的新研究靶点。为深入了解Notch信号通路在神经胶质瘤发生中的作用,探讨沉默Notch治疗神经胶质瘤这一可能的基因治疗方法,本研究利用Notch1-shRNA慢病毒感染人胶质瘤U251细胞,筛选获得Notch1基因稳定沉默的胶质瘤细胞单克隆,对其体内外增殖能力进行研究,并采用基因表达谱芯片技术,分析沉默Notch1对胶质瘤U251细胞的基因表达谱的影响。此外,本研究合成了Notch2的特异siRNA序列,并采用慢病毒介导的RNAi技术研究Notch2基因沉默对胶质瘤U251细胞的体外增殖能力影响,以比较Notch1与Notch2在胶质瘤中功能的异同点。 本研究的第一部分采用实时定量PCR筛选有效的Notch2 siRNA序列,构建Notch2-shRNA慢病毒载体,进行病毒包装,结果成功包装出表达Notch2-shRNA和阴性对照shRNA的慢病毒,滴度分别为3.7×10~5TU/ml和2.5×10~5TU/ml。 本研究的第二部分采用本实验室原有的Notch1-shRNA慢病毒和第一部分生产的Notch2-shRNA慢病毒感染人胶质瘤U251细胞,筛选稳定低表达Notch1和Notch2的细胞单克隆,实时定量PCR检测Notch1和Notch2 mRNA的表达,Western-blot法检测细胞Notch1和Notch2蛋白的表达;结果成功筛选得到Notch1和Notch2稳定沉默的U251细胞单克隆。 本研究的第三部分采用CCK-8法测定细胞生长;平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验检测细胞的集落形成能力;裸鼠种植瘤模型观察Notch1沉默对种植瘤生长的影响。结果显示Notch1稳定沉默组的增殖与对照组相比明显减慢;Notch1沉默组的平板克隆形成率为(18.6±2.5)%,低于对照组(37.0±3.3)%;Notch1沉默组软琼脂集落形成率(51±5)%,低于对照组(80±4)%;Notch1沉默组裸鼠腋下种植瘤生长速度减慢,30天后瘤重(0.31±0.09)g,明显低于对照组(2.35±0.71)g;统计学分析均有显著意义。而Notch2沉默对细胞增殖无影响。 本研究的第四部分采用基因芯片技术,分析Notch1稳定沉默对U251基因表达谱的影响。结果显示Notch1稳定沉默细胞与对照细胞间的差异表达基因共有775个,涉及细胞增殖与分化、细胞周期、细胞通讯与粘附、糖脂代谢、MAPK信号转导、TGF-β信号转导等多个方面,而Notch1沉默抑制肿瘤的机制可能和细胞周期调控以及TGF-β信号有关。


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