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缺氧诱导因子1α的RNAi表达载体构建及其在前列腺癌细胞PC-3研究中的作用

耿爱民  
【摘要】: 目的构建HIF-1α(缺氧诱导因子1α)的RNAi系统表达载体并研究其在前列腺癌细胞PC-3中的作用。 方法根据GenBank中HIF-1α序列信息,化学合成靶向HIF-1α基因的寡核苷酸链,退火、克隆到经双酶切的pSUPER.retro.puro载体上,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析;将重组质粒转染前列腺癌PC-3细胞,评价转染效率;质粒转染48h后收集细胞,检测前列腺癌PC-3细胞内HIF-1αmRNA及其蛋白的表达情况;利用其puro抗药性对转染细胞进行筛选,观察克隆生成情况;将单克隆扩大培养2周后收集细胞株,检测pSUPER-siHIF-1α/PC-3细胞株中HIF-1α蛋白的表达情况。 结果重组质粒经双酶切电泳及序列分析证实,目的片段成功插入到设计位点,并且序列完全一致,表明HIF-1α的RNAi表达载体的构建成功;重组质粒与GFP质粒共转染前列腺癌PC-3细胞36h后转染效率为(87.15±2.36) %;该质粒可显著降低前列腺癌PC-3细胞HIF-1αmRNA及其蛋白的表达,抑制效率分别为75.2%、72.8%(P 0. 05);加药筛选2周可观察到单克隆生成;pSUPER-siHIF-1α/PC-3细胞株中HIF-1α蛋白表达亦显著降低,抑制效率为83.2%(P 0. 05)。 结论利用RNAi技术可成功构建抑制前列腺癌HIF-1α表达的siRNA重组表达载体,为研究HIF-1α在前列腺癌发病机理及增殖、转移中的功能奠定了基础,同时可以用于其在其他肿瘤的功能研究。


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