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用于乳腺蛋白标志基因检测的DNA电化学生物传感器的研究

林启凰  
【摘要】: 乳腺癌是一种严重危害女性身心健康的常见恶性肿瘤,其发病率每年快速递增,而乳腺癌的侵袭转移是导致乳腺癌病人死亡的主要原因。乳腺癌侵袭转移诊断的特异性标记物为乳腺蛋白标志基因,通过对其诊断可为临床乳腺癌转移早期监测、治疗提供科学的研究基础,具有十分重要的学术创新性和临床应用前景。DNA电化学生物传感器是当前生物基因检测技术的前沿研究,具有快速、灵敏、准确、简便经济等特点,在分子生物学和生物工程医学等领域有广泛的应用前景。 本论文利用基于偶联活化剂技术的共价键合法,将乳腺蛋白标志单链DNA序列探针固定到电极表面,再利用电化学交流阻抗检测技术进行DNA杂交前后电信号的检测,并对检测的实验条件进行了优化,构建了基于DNA电化学生物传感器的乳腺蛋白基因检测新方法。实验结果表明,用十二烷基磺酸钠(SDS)作为非特异性吸附去除剂,能够有效的去除单或双链DNA在电极表面的非特异性吸附。在SDS的最佳洗脱时间为3 min,探针固定最佳时间为30min,杂交最佳的温度和时间分别为37℃和20min的优化实验条件下,利用电化学交流阻抗检测技术测得乳腺蛋白标志基因在1.0×10~(-9)~2.0×10~(–8)mol/L的浓度范围内与检测响应信号呈良好的线性关系(r=0.9992),检测限为5×10~(-10)(S/N=3),从而实现对乳腺蛋白标志基因的准确灵敏测定, 此外,该方法对临床乳腺癌实际样本进行了初步实验,并与传统检测乳腺蛋白标志基因的PCR凝胶电泳方法进行对照试验研究。从临床实际阳性样本中提取的mRNA,再转录成cDNA,以转录cDNA为模板进行RT-PCR扩增,获得扩增产物。利用所建新方法,在优化的实验条件下,将扩增产物稀释100倍后进行检测,并进行了回收实验与阴性样本检测的考察,与传统凝胶电泳法进行对照,结果表明该方法检测灵敏、准确度高,为进一步临床实际样品直接检测提供科学实验依据,将为最终应用于临床早期乳腺癌的侵袭转移诊断奠定研究基础。


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