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Notch1基因对人胶质瘤U251细胞增殖和周期的影响及其机制的初步研究

郭亚  
【摘要】: 目的: 1、检测Notch1基因对人胶质瘤U251增殖和细胞周期的影响。 2、探讨Notch1基因影响人胶质瘤U251细胞增殖和周期的可能机制。 方法: 1、利用Notch1-shRNA和pNL-NICD/EGFP慢病毒感染人胶质瘤U251细胞,RT-PCR和Western Blotting法筛选和鉴定Notch1表达下调或Notch1胞内段(Notch1 intracellular domain, NICD)表达上调的U251细胞。 2、MTT法和PI单染流式细胞术分析Notch1对细胞增殖和细胞周期的影响。 3、采用RT-PCR和Western blotting法检测NF-κB p65表达;EMSA法检测NF-κB的活性。 4、采用RT-PCR法检测细胞周期相关基因,包括p53, p21, p27, p16, cyclinD1, cyclinE1, cyclinA2, cyclinB1, cyclinB2, CDK2, CDK4, CDK6, Cdc25C的表达情况,对mRNA表达水平变化的基因,进一步采用Western blotting法检测其蛋白表达水平。 结果: 1、Notch1-shRNA慢病毒表达载体能有效下调U251细胞Notch1的表达,而pNL-NICD/EGFP慢病毒表达载体能有效上调U251细胞NICD的表达。 2、Notch1基因表达下调的细胞其细胞增殖能力受到明显抑制(P0.01),并引起细胞G1期阻滞(P0.01), S期细胞减少(P0.01);在NICD表达上调的细胞其增殖能力明显增强(P0.01),且引起G1期细胞减少(P0.05),S期细胞增加(P0.01)。 3、Notch1基因表达下调的细胞其NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05),NF-κB DNA结合活性显著降低(P0.01);在NICD表达上调的细胞其NF-κB p65mRNA和蛋白表达水平显著增加(P0.01),NF-κB DNA结合活性显著增加(P0.01)。 4、Notch1基因表达下调的细胞其cyclinD1、cyclinA2、CDK2、Cdc25C的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P0.01);而在NICD表达上调的细胞,这些基因的mRNA和蛋白表达水平显著增加(P0.05)。 结论: 1、Notch1基因与人胶质瘤U251细胞的增殖能力和周期调控密切相关。 2、Notch1基因可能通过NF-κB通路影响U251细胞的增殖,且可能部分通过NF-κB p65起作用。 3、Notch1基因可通过cyclinD1、cyclinA2、CDK2和Cdc25C影响U251细胞的周期进程。


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