多个microRNAs通过直接作用于p21的3'UTR调控p21基因的表达

【摘要】： 目的:高通量筛选出能调控p21表达的miRNAs,进行试验验证及初步探索这些miRNAs的生物学功能及意义;初步比较及评价四个软件在靶基因预测方面的价值。 方法:利用分子克隆技术构建并鉴定两个慢病毒表达载体—pWPXL-Luc及pWPXL-Luc-p21-3'UTR,分别与包装载体psPAX-2及PDM2.G共转染HEK 293T细胞,包装出高滴度的病毒颗粒;感染HEK 293细胞,获得稳定单表达荧光素酶及共表达荧光素酶与p21-3'UTR的细胞株,前者在后续试验中作为对照。通过脂质体介导将Dicer1的siRNA (si-Dicer1)转染入HEK 293细胞,real-time PCR从mRNA水平检测其对Dicer1的干扰效果,Western blot检测Dicer1干扰后p21的蛋白表达情况。利用四个生物软件反向预测到266个可能靶向p21-3′UTR的miRNAs;接着,通过脂质体介导将这些miRNAs分别转染入两株细胞中,检测荧光素酶活性,与对照(NC)相比,筛选出可能作用于p21-3′UTR的miRNAs;对初步筛选出来的miRNAs在p21-3′UTR上进行定位,构建并鉴定相应的突变体,连到荧光素酶报告载体上,由脂质体介导与相应miRNAs共转染HEK 293T细胞,36小时后采用双荧光素酶检测试剂检测荧光素酶活性,进行突变体分析;通过脂质体介导将筛选出来的miRNAs分别转染入HEK 293细胞,real-time PCR及Western blot分别从mRNA、蛋白水平进行验证。结合预测结果及实验数据,初步比较及评价四个软件在靶基因预测方面的价值。CCK-8方法及流式细胞仪分别检测其中的8个p21靶向miRNAs对细胞增殖及细胞周期的影响。 结果:酶切鉴定和测序结果证实了pWPXL-Luc及pWPXL-Luc-p21-3'UTR的成功构建;病毒滴度测定及荧光素酶活性检测证实了稳定株的成功建立。si-Dicer1转染入HEK 293细胞48h后,与对照相比,Dicer1 mRNA水平明显下降,p21的蛋白表达水平明显升高。将266个可能靶向p21-3′UTR的miRNAs分别转染入稳定细胞株36h后,与对照(NC)相比,荧光素酶活性检测显示有28个miRNAs能明显降低荧光素酶值,其中包括了文献已报道的能调控p21的miRNAs(miR-93, miR-106a/b, miR-17 and miR-20a/b),而突变体则能逆转这种作用;这些miRNAs分散地分布在p21-3'UTR上的18个结合位点,其中有的miRNAs的结合位点是相同。尽管有些miRNAs不影响p21的mRNA水平,有的甚至略上调,Western blot结果显示转染后p21的表达明显下调,其中以miR-298、miR-515-3p、miR-363、miR-639及miR-132作用尤为明显(4-6倍)。比较分析发现,TargetScan及PicTar在靶基因预测方面有更好的参考价值;在生物软件的发展过程中,并不能完全忽视靶位点的物种非保守性及miRNAs与靶基因的结合中G-U配对是允许的。CCK-8方法及流式细胞仪检测结果显示,定位于人类最大的miRNA基因簇区域—19q13.41(C19MC)的8个p21靶向miRNAs能通过调控p21而促进细胞增殖及细胞周期G1-S转换。 结论:28个miRNAs能通过直接作用于p21的3′UTR在转录后水平负调控p21基因的表达,其中多数miRNAs参与了疾病或肿瘤的发生发展,具有一定的生理或病理意义。在靶基因预测方面,TargetScan及PicTar的参考价值更佳;在生物软件的发展过程中,靶位点的物种非保守性及miRNAs与靶基因的结合中G-U配对需引起重视。