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PTEN脂质磷酸酶抑制剂对实验性阿尔茨海默病细胞模型tau蛋白过度磷酸化的影响

陈斌  
【摘要】: 目的:探讨PTEN脂质磷酸酶抑制剂对实验性阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)细胞模型tau蛋白过度磷酸化的强度和发生时程的影响,分析抑制PTEN脂质磷酸酶活性是否对抗细胞AD样的发生发展,从抑制PTEN脂类磷酸酶活性的角度探索PTEN在AD诱导发生中的作用,以深化理解AD的发病机制,为AD的防治提供新的药物作用靶点。 方法:(1)采用40nmol/L的冈田酸(Okadaic acid, OA)或40μmol/Lβ淀粉样蛋白25~35(βAmyloid protein25~35, Aβ25~35)诱导SH-SY5Y细胞,? Western blot法测定OA或Aβ25~35诱导作用后各时间点细胞中磷酸化tau蛋白水平的变化情况,显微观察诱导作用后细胞形态的变化,以细胞形态学变化和磷酸化tau蛋白水平作为反映细胞AD样发生发展的指标,建立AD样SH-SY5Y细胞模型。(2)10、30、90 nmol/L PTEN脂质磷酸酶抑制剂BPV(pic)和40 nmol/L OA或40μmol/L Aβ25~35同时作用于SH-SY5Y细胞18 h后,Western blot法测定细胞中磷酸化tau蛋白水平的变化情况,分析抑制PTEN脂质磷酸酶活性对AD样SH-SY5Y细胞中tau蛋白磷酸化强度的影响。(3)采用90nmol/L BPV(pic)预先处理细胞1h,然后加入40 nmol/L OA或40μmol/L Aβ25~35作用于SH-SY5Y细胞,Western blot法测定OA或Aβ25~35诱导作用后各时间点(0、3、6、12、18、24、36、48h)细胞中磷酸化tau蛋白水平的变化情况,分析抑制PTEN脂质磷酸酶活性对AD样SH-SY5Y细胞中tau蛋白磷酸化发生时程的影响。 结果:1、PTEN脂质磷酸酶抑制剂BPV(pic)对OA诱导的SH-SH5Y细胞中磷酸化tau蛋白的水平的影响。①40nmol/L OA孵育SH-SY5Y细胞可显著改变细胞的形态,随OA孵育时间的延长,SH-SY5Y细胞可发生进行性的损伤变性;40nmol/L OA作用于细胞,细胞内Ser396位点磷酸化tau蛋白水平在OA孵育后12h升高, 18h、24h达高峰,之后下降,48h显著降低;PTEN蛋白水平在OA孵育6h后升高,之后下降,提示OA可诱导SH-SY5Y细胞活性下降、tau蛋白过度磷酸化,以此判定OA诱导的AD样SH-SY5Y细胞模型的建立。②BPV(pic) (10-90 nmol/L)可显著升高SH-SY5Y细胞中Ser473位点磷酸化Akt蛋白水平,作用随剂量增大而增强,间接提示所选用的浓度范围内BPV(pic)可剂量依赖性抑制PTEN脂质磷酸酶的活性。单用90nmol/LBPV(pic)对SH-SY5Y细胞中磷酸化tau蛋白水平未见显著影响;BPV(pic)(10-90 nmol/L)可显著降低OA诱导的SH-SY5Y细胞内磷酸化tau蛋白的水平,作用随剂量增大而增强,提示PTEN脂质磷酸酶抑制剂BPV(pic)可削弱OA诱导SH-SY5Y细胞内tau蛋白磷酸化的强度。③经过90nmol/L BPV(pic)预处理的SH-SY5Y细胞中磷酸化tau蛋白水平在OA诱导24、36h时最高,48h下降;与生理盐水预处理的OA诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的变化时程相比,可见经90nmol/L BPV(pic)预处理可延缓OA诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的发生发展。2、PTEN脂质磷酸酶抑制剂BPV(pic)对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的SH-SY5Y细胞中磷酸化tau蛋白水平的影响。①40μmol/L Aβ25~35孵育SH-SY5Y细胞可显著改变细胞的形态,随Aβ25~35孵育时间的延长,SH-SY5Y细胞可发生进行性的损伤变性;40μmol/L Aβ25~35作用于细胞,细胞内Ser396位点磷酸化tau蛋白水平在Aβ25~35孵育后6h升高, 12h达高峰,之后下降,48h显著降低;PTEN蛋白水平在Aβ25~35孵育6h后升高,之后下降,提示Aβ25~35可诱导SH-SY5Y细胞活性下降、tau蛋白过度磷酸化,以此判定Aβ25~35诱导的AD样SH-SY5Y细胞模型的建立。②BPV(pic) (10-90 nmol/L)可显著升高SH-SY5Y细胞中Ser473位点磷酸化Akt蛋白水平,作用随剂量增大而增强,间接提示所选用的浓度范围内BPV(pic)可剂量依赖性抑制PTEN脂质磷酸酶的活性。单用90nmol/LBPV(pic)对SH-SY5Y细胞中磷酸化tau蛋白水平未见显著影响;BPV(pic)(10-90 nmol/L)可显著降低Aβ25~35诱导的SH-SY5Y细胞内磷酸化tau蛋白的水平,作用随剂量增大而增强,提示PTEN脂质磷酸酶抑制剂BPV(pic)可削弱Aβ25~35诱导SH-SY5Y细胞内tau蛋白磷酸化的强度。③经过90nmol/L BPV(pic)预处理的SH-SY5Y细胞中磷酸化tau蛋白水平在Aβ25~35诱导24、36h时最高,48h下降;与生理盐水预处理的Aβ25~35诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的变化时程相比,可见经90nmol/L BPV(pic)预处理可延缓Aβ25~35诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的发生发展。 结论: 1、抑制PTEN脂质磷酸酶活性对OA诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白过度磷酸化具有对抗作用。 2、抑制PTEN脂质磷酸酶活性对Aβ25~35诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白过度磷酸化具有对抗作用。 3、抑制PTEN脂质磷酸酶活性对细胞AD样的发生可能具有对抗作用,提示PTEN脂质磷酸酶活性的异常增强可能具有促进AD发生的作用,PTEN有望成为新的抗AD药物作用靶点。


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