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ACE2基因表达增加对血管紧张素Ⅱ作用下人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡的影响

王前胜  
【摘要】: 目的构建携带ACE2基因的慢病毒表达载体,观察其感染人脐静脉内皮细胞后ACE2表达增加对AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞增殖活性降低与凋亡增加的影响,初步探讨该影响的机制。 方法1.采用PCR技术从含有ACE2基因的质粒克隆模板pc-DNA3.1-hygro(+)-mACE2上钓取ACE2基因,并将ACE2基因重组到慢病毒载体表达质粒pGC-FU中,构建重组慢病毒载体表达质粒pGC-FU-ACE2,通过酶切、测序验证ACE2基因后,将pGC-FU-ACE2质粒和包装质粒pHelper1.0,pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带ACE2基因的重组慢病毒(Lentiviral-ACE2)。2.以感染复数为10(MOI=10)感染人脐静脉内皮细胞,感染72小时后通过RT-PCR,Western-blot检测各组细胞ACE2基因的转录和蛋白表达水平3. Lentiviral-ACE2感染原代培养人脐静脉内皮细胞后给予AngⅡ(终浓度10-7mol/L)处理,随机分为正常细胞组、AngⅡ组、AngⅡ+Lentiviral-GFP组和AngⅡ+Lentiviral-ACE2组,通过倒置相差显微镜观察各组HUVEC的形态学变化,AlamarBlue试剂检测各组HUVEC增殖功能,TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测各组HUVEC的凋亡,初步探讨ACE2发挥上述作用的机制。 结果1.成功构建携带ACE2基因的慢病毒表达载体(Lentiviral-ACE2),并获得大量高纯度的慢病毒浓缩液2.目的基因ACE2能被重组慢病毒高效地导入人脐静脉血管内皮细胞,并能高水平表达。3. AngⅡ组与AngⅡ+Lentiviral-GFP组细胞生长状态差,生长缓慢,形态不规则并且有不同程度脱壁悬浮的细胞;而正常细胞对照组与AngⅡ+Lentiviral-ACE2组细胞生长状态良好,圆形、卵圆形,饱满,形态正常呈“铺路石”样生长,紧密贴壁,悬浮细胞少;AngⅡ组AlamarBlue被还原率较正常细胞组明显降低(P0.05),AngⅡ+ Lentiviral-ACE2组较AngⅡ组AlamarBlue被还原率显著增高(P0.05);AngⅡ组的凋亡指数(0.1165±0.0181)与正常细胞对照组凋亡指数(0.0373±0.0113)相比具有明显统计学意义(P0.05),同时与AngⅡ+Lentiviral-ACE2组凋亡指数(0.0540±0.0061)相比,也具有明显统计学意义(P0.05)。AngⅡ组与AngⅡ+Lentiviral-GFP相比、正常细胞对照组与AngⅡ+Lentiviral-ACE2组相比的AlamarBlue被还原率和凋亡指数无统计学意义。 结论慢病毒表达载体Lentiviral-ACE2成功构建并能高效率感染人脐静脉内皮细胞;AngⅡ具有促进人脐静脉内皮细胞增殖能力下降和凋亡增加的作用,ACE2表达增加能抑制AngⅡ诱导的人脐静脉内皮细胞增殖活性降低和凋亡增加,对人脐静脉内皮细胞具有保护作用。


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