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基于PI3K/Akt信号转导通路探讨麝香通心滴丸抗心肌缺血的物质基础和作用机制

林珊  
【摘要】:目的心肌缺血发病率逐年增高,目前主要干预措施是手术和药物治疗。麝香通心滴丸治疗冠心病疗效确切,但其对心肌保护作用的机制仍有盲点。本课题从多角度探讨麝香通心滴丸对心肌缺血PI3K/Akt信号转导通路的影响以及其有效成分的分析,以阐明麝香通心滴丸治疗心肌缺血的作用机制和物质基础。方法1.采用腹腔注射垂体后叶素建立SD大鼠急性心肌缺血动物模型。随机分为空白组(0.9%生理盐水灌胃),模型组(0.9%生理盐水灌胃),对照组(单硝酸异山梨酯4.0 mg/kg-d药液灌胃),麝香通心滴丸高剂量组(42mg/kg·d药液灌胃),麝香通心滴丸中剂量组(21 mg/kg·d药液灌胃),连续给药1周后,腹腔注射垂体后叶素,造模后检测大鼠心电图ST段的变化,分别取大鼠心肌和腹主动脉血液,ELISA检测血液中LDH和CK-MB浓度的变化,光镜观察HE染色心肌组织病理形态学变化,TUNEL检测心肌细胞凋亡情况,qRT-PCR和免疫组化检测心肌组织PI3K/Akt通路活化及其下游凋亡相关基因表达的影响。2.采用Na_2S_2O_4诱导心肌细胞建立体外心肌缺血缺氧细胞模型。MTT检测心肌细胞的活力情况,用梯度浓度法优化Na_2S_2O_4诱导心肌细胞凋亡以及麝香通心滴丸干预心肌细胞凋亡模型的量效关系和时效关系。随机分为空白组、Na_2S_2O_4模型组、麝香通心滴丸高剂量组(50μg/ml)、麝香通心滴丸低剂量组(25 μg/ml)。麝香通心滴丸组预给药后,除空白组外,分别加入Na_2S_2O_4干预,再正常培养复氧后,MTT检测心肌细胞活力,Hoechst染色和流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡情况,qRT-PCR及Western blot观察心肌细胞PI3K/Akt通路活化及其下游凋亡相关基因表达的影响。3.通过LC-Q-TOF-MS和GC-MS联用技术,摸索最佳色谱和质谱条件,对麝香通心滴丸的化学成分进行分析鉴定;MTT和梯度浓度法优化主要化学成分干预Na_2S_2O_4诱导心肌细胞缺血缺氧模型的有效浓度;采用高内涵细胞分析仪检测麝香通心滴丸有效成分对Hoechst 33258染色心肌细胞的凋亡情况。结果1.麝香通心滴丸对垂体后叶素造模建立的大鼠心肌缺血模型的影响。实验结果表明麝香通心滴丸能显著性抑制ST段的抬高(P0.05),显著降低血液中LDH和CK-MB的含量(P0.05),明显改善心肌组织损伤,降低心肌细胞凋亡数(P0.05)。并且麝香通心滴丸下调了 Bax的表达,上调了 PI3K、p-Akt和Bcl-2的表达,与模型组比较,有显著性差异(P0.05)。2.麝香通心滴丸对Na_2S_2O_4诱导建立的H9c2心肌细胞缺血缺氧模型的影响。用50μg/ml和25 μg/ml浓度的麝香通心滴丸预给药12 h,作为有效作用浓度和时间,加入1 mmol/mlNa_2S_2O_4干预4h,复氧6h,作为诱导心肌细胞凋亡的有效作用浓度和时间。各组干预后,麝香通心滴丸各浓度组的心肌细胞形态改善,明显好于Na_2S_2O_4模型组,凋亡细胞减少,细胞的存活率显著性高于Na_2S_2O_4模型组(P0.05);减少了心肌细胞的凋亡率,不同程度地下调了 Bax的表达,上调了 PI3K、p-Akt和Bcl-2的表达,与模型组比较,有显著性差异(P0.05)。3.麝香通心滴丸抗心肌缺血的药效物质基础的初步研究。建立最佳色谱和质谱条件,分析并鉴定麝香通心滴丸挥发性化学成分17个,主要是麝香酮、龙脑和异龙脑等;非挥发性成分41个,主要为胆酸类、人参皂苷类、丹酚酸类和蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物等。对主要化学成分进行活性筛选,结果表明,有效成分麝香酮、龙脑、异龙脑、胆酸、人参皂苷Rg1和Rg3等能不同程度地增强缺血缺氧心肌细胞的活力。结论麝香通心滴丸可通过抑制PI3K/Akt信号通路上重要因子的信号转导,减少心肌细胞的凋亡数目,改善心肌细胞形态,减轻心肌细胞破坏程度,维持心肌组织结构的相对完整,从而改善心肌缺血程度,具有心肌保护作用。可能通过麝香通心滴丸含有的麝香酮、龙脑、异龙脑和胆酸类等有效成分起药效作用,初步阐明麝香通心滴丸抗心肌缺血的物质基础,为进一步揭示复方多成分多靶点的作用机制提供了理论依据。


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