从LXRs/NF-κB通路探讨壮骨健膝方对KOA滑膜炎症影响的实验研究

【摘要】：目的旨在从人关节滑膜相关细胞与组织的炎症调控及LXRs/NF-κB通路关键节点蛋白的表达角度阐明壮骨健膝方对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)滑膜炎症的干预效应及机制,进一步丰富该方针对KOA痹痿同治中“除痹”功效的科学内涵。方法1.文献梳理 系统整理包括膝关节滑膜组织的生理病理,滑膜炎症在KOA发病中的作用,KOA软骨退化及炎症因子、MMPs表达与KOA滑膜炎症的关系,KOA滑膜炎症的信号通路调控,KOA滑膜炎症的中医病因病机、辨证论治概况及中西医康复进展,课题组对KOA滑膜炎症的认识与研究思路、前期相关研究基础,壮骨健膝方的组方原则等文献资料,全面梳理并分析KOA滑膜炎症与软骨退化、KOA滑膜炎症与KOA痹痿并见病机的内涵及KOA滑膜炎症的防治康复要点。2.实验研究 主要采用经LPS刺激的人膝滑膜巨噬细胞和KOA滑膜炎症患者滑膜组织两种体外实验研究模型,分为两部分开展研究。2.1壮骨健膝方含药血清干预经LPS刺激的人膝滑膜巨噬细胞的研究(1)制备壮骨健膝方含药血清 普通级3月龄新西兰大白兔12只随机分为空白血清组、含药血清组(n=6)。含药血清组给予壮骨健膝方4.58 mL/kg/d药液灌胃,空白血清组给予等体积生理盐水灌胃,2次/d,连续3d,于末次灌胃1h后,在腹腔注射麻醉下腹主动脉采血。离心收集血清,56℃水浴30 min灭活、过滤,分装,冰箱-20℃储存备用。(2)LPS刺激滑膜巨噬细胞的最佳浓度和时间的确定 将生长状态良好的滑膜巨噬细胞随机分为0μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mLLPS组,加入含对应浓度LPS的完全培养液,分别于培养8 h、12 h、18 h、24 h后,采用ELISA法检测各组细胞上清液中炎症因子IL-1β、TNF-α的含量,以炎症因子含量较高一组的浓度和时间作为后续研究中复制滑膜巨噬细胞炎症模型的最佳浓度和时间。(3)含药血清干预滑膜巨噬细胞炎症模型的最佳浓度和时间的确定 将生长状态良好的滑膜巨噬细胞经前确定的LPS的最佳浓度和时间干预后,随机分为0%、5%、10%、20%的含药血清组,分别加入相应浓度的壮骨健膝方含药血清完全培养液,分别于培养12 h、24 h、36 h和48 h后,采用ELISA法检测各组细胞上清液中炎症因子IL-1β、TNF-α的含量,以炎症因子含量较低一组的浓度和时间作为后续研究中含药血清干预滑膜巨噬细胞炎症模型的条件。(4)含药血清对滑膜巨噬细胞的分组干预 将生长状态良好的滑膜巨噬细胞随机分成正常组和LPS组。正常组加入含10%FBS的完全培养液,LPS组经LPS刺激后将其随机分为模型组、含药血清组、LXRα阻滞剂组、N-CoR阻滞剂组。再采用含经前确定浓度的空白血清、壮骨健膝方含药血清以及相应阻滞剂的完全培养液对各组滑膜巨噬细胞干预既定时间后,收集细胞及上清液。采用ELISA法检测各组滑膜细胞上清液中炎症因子IL-1β、TNF-α含量;运用Western Blot、RT-qPCR技术检测各组滑膜细胞中LXRα、N-CoR、P50、P65蛋白及mRNA的表达情况进行检测,统计分析结果。2.2壮骨健膝方含药血清干预KOA滑膜炎症患者滑膜组织的研究(1)同2.1方法制备壮骨健膝方含药血清。(2)滑膜组织的收集、培养 收集由福州中西医结合医院骨二区关节外科确诊有原发性KOA滑膜炎并符合纳入标准的患者于全膝关节置换术中切取的滑膜组织,以及因交叉韧带或半月板损伤行关节镜下修复且未诊断有慢性滑膜炎症患者正常手术过程刨削下的滑膜组织。临床获得的标本先置预冷无菌D-Hank's液的EP管中,经75%酒精消毒后随即转移到超净工作台。用眼科手术剪仔细剔除滑膜组织周围的脂肪组织等,剪碎成肉眼可见的约1～2 mm3大小的组织块,经D-Hank's液自然漂洗、沉淀后置于无菌6孔板,每孔5块均匀排列,为使组织块更好地附着在底板上,先将6孔板盖板后翻转后于37℃、5%CO2培养箱中倒置1 h,再缓慢加入含10%FBS的完全培养液于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。(3)含药血清干预KOA滑膜炎症患者滑膜组织的最佳浓度和时间的确定 随机将KOA滑膜炎患者滑膜组织小块分为0%、5%、10%、20%含药血清组,分别加入含相应浓度的壮骨健膝方含药血清完全培养液,分别于培养3d、5 d、7 d、10 d后,采用ELISA法检测各组滑膜组织匀浆上清液中炎症因子IL-1β、TNF-α的含量,以炎症因子含量较低时一组的浓度和时间作为后续研究中含药血清干预滑膜炎症组织的条件。(4)含药血清对滑膜组织的分组干预 取足量KOA滑膜炎患者滑膜组织小块,随机分为4组,即滑膜炎症组、含药血清组、LXRα阻滞剂组、N-CoR阻滞剂组,每组3孔,每孔5个组织小块。另取等量正常滑膜组织小块作为正常组。再采用含经前确定浓度的空白血清、壮骨健膝方含药血清以及对应的阻滞剂的完全培养液对各组滑膜组织进行干预既定时间后,光镜下观察各组滑膜组织小块周围细胞游出情况,然后弃培养液,分别收集并每组随机取6个滑膜组织小块,经4%多聚甲醛固定、脱水、包埋后,采用HE染色观察滑膜组织形态学变化、免疫荧光染色技术观察滑膜组织中成纤维细胞Smooth Musle Actin(SMA)特异性标记物的表达强度、免疫组化检测滑膜组织LXRα、N-CoR、P50、P65蛋白表达;各组其余滑膜组织称重后各取0.2 g滑膜组织,放入玻璃匀浆管,加入1.8 mLPBS缓冲液,研碎充分后收集滑膜组织匀浆液,离心、取匀浆上清液行ELISA法检测IL-1β、TNF-α、MMP-3及MMP-13含量,并对结果进行统计分析。结果1.文献梳理方面(1)普遍认为KOA滑膜炎症是引起患者关节肿胀、疼痛、僵硬及屈伸活动受限的重要原因,KOA滑膜炎症与KOA软骨退化常同时存在,相互影响。(2)研究已证实LXRs/NF-κB通路与KOA滑膜炎症的发生发展密切相关,LXRα、N-CoR、P50及P65等关键节点蛋白表达异常参与了滑膜的炎症过程。(3)“痹痿并见”是KOA所致功能障碍的主要特点,KOA滑膜炎症属于痹证中“筋痹”范畴,KOA软骨退化属于“痿证”范畴;痹痿可互相影响,在防治与康复中要求痹痿同治、除痹起痿,以体现整体治疗。(4)壮骨健膝方具“痹痿同治”的功效,在前期从“治痿”角度对关节软骨退化影响观察及阐释的基础上,有待进一步从滑膜炎症影响的角度对其“除痹”作用的科学内涵展开深入研究。2.实验研究方面2.1壮骨健膝方含药血清对LPS刺激的人膝滑膜巨噬细胞的影响(1)LPS刺激人膝滑膜巨噬细胞的浓度与时间 通过对比不同浓度LPS刺激滑膜巨噬细胞不同时间后IL-1β、TNF-α含量的变化,得出浓度为1.0 ug/mL的LPS刺激滑膜巨噬细胞12h及18h时IL-1β、TNF-α的含量相对最高,考虑研究时间及成本,得出浓度为1.0 ug/mL的LPS刺激滑膜巨噬细胞12 h时IL-1β、TNF-α的含量相对最高,并以此作为后续干预的条件。(2)含药血清干预人膝滑膜巨噬细胞炎症模型的浓度与时间 通过对比不同浓度壮骨健膝方含药血清干预滑膜巨噬细胞炎症模型不同时间后IL-1β、TNF-α含量的变化,得出浓度为10%的含药血清干预24 h、36 h及48 h时IL-1β、TNF-α含量最低,考虑研究时间及含药血清制备成本,以10%的含药血清干预24 h作为后续干预的条件。(3)相关指标检测结果1)干预后各组滑膜巨噬细胞LXRα、N-CoR、P50、P65蛋白表达的变化 干预后各组间LXRα、N-CoR、P50、P65蛋白表达卡方检验F值分别为47.946、50.648、40.317、35.553,有显著性差异。与正常组比较,模型组LXRα、N-CoR蛋白表达显著降低,P50、P65蛋白表达显著升高(P均0.01)。与模型组比较,含药血清组LXRα、N-CoR蛋白表达显著升高,P50、P65蛋白表达显著降低(P0.01或P0.05);LXRα阻滞剂组LXRα、N-CoR蛋白表达无显著差异(P0.05)、P50、P65蛋白表达均显著下降(P0.01或P0.05);N-CoR阻滞剂组LXRα蛋白表达显著升高(P0.01)、N-CoR蛋白表达无显著差异(P0.05),P50、P65蛋白表达显著降低(P0.01或P0.05)。与LXRα阻滞剂组比较,含药血清组LXRα、N-CoR蛋白均显著升高(P均0.01),P50、P65蛋白表达均显著下降(P均0.01)。与N-CoR阻滞剂组比较,含药血清组LXRα、N-CoR蛋白均显著升高(P均0.01),P50、P65蛋白表达均显著下降(P0.01 或P0.05)。2)干预后各组滑膜巨噬细胞LXRα、N-CoR、P50、P65 mRNA表达的变化 干预后各组间LXRα、N-CoR、P50、P65 mRNA表达卡方检验F值分别为60.123、48.313、38.036、42.682,有显著性差异。与正常组比较,模型组LXRα、N-CoR mRNA表达显著降低,P50、P65 mRNA表达显著升高(P均0.01)。与模型组比较,含药血清组LXRα、N-CoR mRNA表达显著升高,P50、P65 mRNA表达显著降低(P0.01或P0.05);LXRα阻滞剂组LXRα、N-CoRmRNA表达无显著差异(P0.05)、P50、P65 mRNA表达均显著下降(P0.01或P0.05);N-CoR阻滞剂组LXRα mRNA表达显著升高(P0.01)、N-CoR mRNA 表达无显著差异(P0.05),P50、P65 mRNA 表达显著降低(P0.01或P0.05)。与LXRα阻滞剂组比较,含药血清组LXRα、N-CoR mRNA表达均显著升高(P均0.01),P50、P65蛋白表达均显著下降(P均0.01)。与N-CoR阻滞剂组比较,含药血清组LXRα、N-CoR蛋白均显著升高(P均0.01),P50、P65蛋白表达均显著下降(P均0.01)。3)干预后各组滑膜巨噬细胞上清液中炎症因子表达的变化 干预后各组间IL-1β、TNF-α含量变化卡方检验F值分别为41.294、35.240,有显著性差异。与正常组比较,模型组IL-1β、TNF-α含量均显著升高(P0.01);与模型组比较,含药血清组干预后IL-1β、TNF-α含量均显著降低(P0.01或P0.05),LXRα阻滞剂组和N-CoR阻滞剂组含量均显著降低(P0.01或P0.05);与LXRα阻滞剂组比较,含药血清组IL-1β、TNF-α含量均显著降低(P0.01或P0.05);与N-CoR阻滞剂组比较,含药血清组IL-1β、TNF-α含量均显著降低(P0.01或P0.05)。2.2壮骨健膝方含药血清对KOA滑膜炎症患者滑膜组织的影响(1)正常组与滑膜炎症组滑膜组织HE染色的比较正常组可见滑膜组织中脂肪细胞较多,滑膜表层平整,滑膜内衬层细胞为1-3层,细胞分布较均匀且序列整齐,无血管增生,无或偶见炎性细胞。滑膜炎症组可见滑膜组织中脂肪细胞较少,滑膜表层不平整,滑膜内衬层细胞层数增生明显,可达5-9层,细胞排列紊乱,可见较多炎性细胞浸润。(2)含药血清干预滑膜组织的浓度和时间 通过对比不同浓度壮骨健膝方含药血清干预KOA滑膜炎症患者滑膜组织不同时间后IL-1β、TNF-α含量的变化,得出浓度为10%的含药血清干预7 d及10 d时IL-1β、TNF-α含量最低,考虑研究时间和含药血清制备成本,10%的含药血清干预7 d为后续干预的条件。(3)干预前后光镜下各组滑膜组织小块周围细胞游出情况 干预前,各组滑膜组织边缘均有少量贴壁细胞增殖,多数细胞呈圆形、椭圆形或长梭形,向心聚集状单层排列。干预7d后,光镜下观察,滑膜炎症组、LXRα阻滞剂组、N-CoR阻滞剂组边缘有大量贴壁细胞,多数细胞呈长梭形或星形,中心部呈向心聚集状多层排列,周围部细胞生长排列紊乱;正常组、含药血清组滑膜边缘有大量贴壁细胞,多数细胞呈椭圆形或长梭形,向心状聚集多单层排列,铺路石样。(4)相关指标检测结果1)干预后各组滑膜组织成纤维细胞特异性标志物SMA免疫荧光表达强度变化 与正常组相比,滑膜炎症组ID值显著升高(P0.01);与滑膜炎症组相比,含药血清组、LXRα阻滞剂组及N-CoR阻滞剂组ID值显著降低(P均0.01)。与LXRα阻滞剂组比较,含药血清组ID值显著降低(P0.01)。与N-CoR阻滞剂组比较,含药血清组ID值显著降低(P0.01)。2)干预后各组滑膜组织HE染色的变化 干预后,与正常组比较,滑膜炎症组存在明显滑膜组织增生、炎性细胞浸润,且滑膜细胞呈紊乱排列等病理改变,形态学评分有显著性差异(P0.01);与滑膜炎症组比较,含药血清组、LXRα阻滞剂组和N-CoR阻滞剂组滑膜组织增生、炎性细胞浸润等病理改变减轻,形态学评分明显降低(P0.05或P0.01);与LXRα阻滞剂组比较,含药血清组滑膜组织增生、炎性细胞浸润等病理改变较轻,形态学评分降低(P0.05);与N-CoR阻滞剂组比较,含药血清组滑膜组织增生、炎性细胞浸润等病理改变较轻,形态学评分降低(P0.05)。3)干预后各组滑膜组织匀浆上清液中IL-1β、TNF-α含量的变化 干预后各组间IL-1β、TNF-α含量变化卡方检验F值分别为55.306、73.699,有显著性差异。与正常组比较,滑膜炎症组IL-1β及TNF-α含量显著升高(P0.01);与滑膜炎症组比较,含药血清组、LXRα阻滞剂组及N-CoR阻滞剂组IL-1β及TNF-α含量均显著降低(P0.05或P0.01);与LXRα阻滞剂组比较,含药血清组IL-1β及TNF-α含量均显著降低(P均0.01);与N-CoR阻滞剂组比较,含药血清组IL-1β及TNF-α含量均显著降低(P均0.01)。4)干预后各组滑膜组织匀浆上清液中MMP-3、MMP-13含量的变化 干预后各组间MMP-3、MMP-13含量变化卡方检验F值分别为422.496、106.809,有显著性差异。与正常组比较,滑膜炎症组MMP-3、MMP-13含量显著升高(P0.01);与滑膜炎症组比较,含药血清组、LXRα阻滞剂组、N-CoR阻滞剂组MMP-3及MMP-13含量均显著降低(P均0.01);与LXRα阻滞剂组比较,含药血清组MMP-3、MMP-13含量均显著降低(P均0.01);与N-CoR阻滞剂组比较,含药血清组含量均显著降低(P均0.01)。5)干预后各组滑膜组织LXRα、N-CoR、P50、P65蛋白表达的变化 干预后各组间LXRα、N-CoR、P50、P65蛋白免疫组化IOD值表达卡方检验F值分别为73.205、14.235、48.416、124.092,有显著性差异。与正常组比较,滑膜炎症组LXRα、N-CoR的IOD值显著下降(P0.01),P50、P65的IOD值显著上升(P0.01)。与滑膜炎症组比较,含药血清组LXRα、N-CoR的IOD值显著升高(P0.05),P50、P65的IOD值显著下降(P0.01);LXRα阻滞剂组LXRα、N-CoR的IOD值表达无显著差异(P0.05),P50、P65 的 IOD 值均显著下降(P0.01);N-CoR 阻滞剂组 LXRα的 IOD值显著升高(P0.05),N-CoR的IOD值无显著差异(P0.05),P50、P65的IOD值显著降低(P0.01或P0.05)。与LXRα阻滞剂组比较,含药血清组LXRα、N-CoR的IOD值表达均显著上升(P均0.01),P50、P65的IOD值均显著下降(P均0.05);与N-CoR阻滞剂组比较,含药血清组LXRα、N-CoR的IOD值表达均显著上升(P均0.01),P50、P65的IOD值均显著下降(P均0.05)。结论1.按照中医理论,KOA所致功能障碍具有“痹痿并见”的特点,KOA滑膜炎症与软骨退化所致功能障碍分属“痹证”“痿证”范畴且相互影响,故应采用痹痿同治、除痹起痿的防治与康复治则。2.壮骨健膝方可以改善滑膜巨噬细胞的炎症状态,并减少炎症因子IL-1β、TNF-α的分泌。壮骨健膝方这种作用与其对滑膜巨噬细胞炎症模型上的LXRs/NF-κB通路干预有关,具体表现为上调该通路LXRα、N-CoR蛋白及mRNA表达,影响P50、P65蛋白及mRNA表达,减少下游炎症因子IL-1β、TNF-α的表达。3.体外培养的KOA滑膜炎症患者滑膜组织出现滑膜成纤维细胞增殖、炎症因子及基质金属蛋白酶含量升高;壮骨健膝方可抑制KOA滑膜炎症患者滑膜组织成纤维细胞增殖、减少炎症因子的分泌、降低基质金属蛋白酶含量,减轻滑膜炎症。其机制可能与其对滑膜组织中巨噬细胞LXRs/NF-κB通路上关键节点蛋白的表达调控,降低NF-κB信号通路活性有关。4.壮骨健膝方对KOA滑膜炎症“除痹”功效的发挥与其影响滑膜组织中巨噬细胞LXRs/NF-κB通路中关键节点蛋白表达,降低NF-κB通路活性,减少下游炎症因子IL-1 β、TNF-α的表达,改善滑膜成纤维细胞增生情况,从而减轻滑膜炎症等密切相关。