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成骨细胞G1期调节蛋白与绝经后骨质疏松症关系及中药干预作用的实验研究

吴银生  
【摘要】: 一、目的 揭示成骨细胞G1期调节蛋白Cyclin D1、CDK4、p21与实验性绝经后骨质疏松症的关系,并在细胞分子水平研究健骨颗粒对成骨细胞G1期调控的影响,进一步探讨中医药有效防治绝经后骨质疏松症的详细机制。 二、方法 1、去卵巢骨质疏松模鼠成骨细胞G1期调节蛋白的改变及健骨颗粒干预作用 (1)建立实验动物病理模型:切除6月龄SD大鼠卵巢建立绝经后骨质疏松症动物模型。 (2)具体分组与药物干预:170只6月龄SD雌性大鼠,随机分成假手术组50只和手术组120只。手术组进行双侧卵巢结扎切除术,假手术组除未行卵巢结扎切除外,其余步骤与手术组相同。手术组在手术后再分成模型组70只,预防组50只。预防组于术后第2天开始喂服健骨颗粒2g·kg~(-1)·d~(-1),每天1次。术后13周模型组再随机分出20只为治疗组。治疗组喂服健骨颗粒2g·kg~(-1)·d~(-1),假手术组和模型组喂服生理盐水2ml·d~(-1)。健骨颗粒以生理盐水溶解后灌服。治疗组、假手术组及模型组均从术后第13周起灌服。所有大鼠于术后4、8、12、18、24周分批取材,每批每组各处死10只。 (3)指标检测:应用双能X线骨密度仪测定全身骨密度;运用放射免疫法检测血清E_2水平;运用免疫组织化学方法检测骨组织中成骨细胞G1期调节蛋白Cyclin D1、CDK4、p21蛋白表达。 2、健骨颗粒含药血清对体外培养成骨细胞G1期调节蛋白的影响 (1)建立成骨细胞体外培养体系:原代细胞用酶消化法从新生SD大鼠颅盖骨获取,经碱性磷酸酶染色、钙化结节茜素红染色鉴定后,取第三代细胞进行实验。 (2)健骨颗粒含药血清制备:取3月龄清洁级雄性SD大鼠20只,随机分为含药血清组和空白血清组,每组10只,含药血清组给予健骨颗粒2g·kg~(-1)·d~(-1),空白血清组灌服生理盐水2ml·d~(-1),二组均连续灌胃7天,取血制备成健骨颗粒含药血清和生理盐水空白血清。 (3)检测指标:MTT法检测不同含药血清浓度对成骨细胞增殖的影响,得出最佳含药血清浓度;以最佳浓度的含药血清作用于成骨细胞24h、48h和72h,以空白血清干预的细胞为对照,运用流式细胞术进行细胞周期分析、检测Cyclin D1阳性细胞百分含量,运用免疫细胞化学法检测Cyclin D1、CDK4、p21蛋白的表达,运用RT-PCR法检测Cyclin D1、CDK4、p21 mRNA表达。 三、结果 1、术后12周后,模型组全身BMD明显下降(P<0.01),且随时间推移下降趋势明显,预防组、治疗组BMD明显高于同期模型组,但不及假手术组;模型组血清E_2水平下降明显(P<0.01),预防组、治疗组E_2水平明显高于同期模型组,预防组高于治疗组,但不及假手术组;Cyclin D1、CDK4蛋白阳性表达主要定位于骨小梁表面的成骨细胞,假手术组有Cyclin D1、CDK4蛋白阳性表达,模型组、预防组、治疗组表达强于假手术组,以预防组表达最高,治疗组次之;p21蛋白阳性表达部位与Cyclin D1相似,假手术组、模型组、预防组和治疗组均有明显阳性表达,假手术组表达最低,模型组的表达维持在较高水平,在各时期均明显高于同期假手术组、预防组和治疗组。 2、(1)MTT法检测显示健骨颗粒含药血清浓度为20%时,体外培养成骨细胞增殖速度最快,明显快于同浓度空白血清组(P<0.05)。(2)流式细胞术检测细胞周期分布结果显示,随着干预时间延长,G0/G1期细胞分数下降,而S期、G2/M期细胞分数上升,增殖指数(PI)升高,以含药血清组变化明显,干预24h、48h、72h,其S期细胞分数、PI均高于空白血清组(P<0.05);流式细胞术检测Cyclin D1阳性细胞百分含量,含药血清组明显高于空白血清组(P<0.01)。(3)免疫细胞化学检测显示,体外成骨细胞Cyclin D1、CDK4蛋白有阳性表达,表达部位主要在细胞核,随着干预时间的延长,含药血清组和空白血清组Cyclin D1、CDK4蛋白表达呈上升趋势,含药血清组明显高于空白血清组(P<0.05或P<0.01);在p21的表达上,二组随时间的推移则呈下降趋势,且含药血清组低于空白血清组,干预48h、72h时二组比较有显著性差异(P<0.01)。(4)RT-PCR检测结果与免疫细胞化学检测结果基本一致,干预48h、72h,含药血清组Cyclin D1、CDK4 mRNA表达明显高于空白血清组(P<0.05或P<0.01);干预24h,含药血清组p21 mRNA表达明显低于空白血清组(P<0.05),干预48h、72h,二者的差距更明显(P<0.01)。 四、结论 1去卵巢骨质疏松模型大鼠发病过程中,随着雌激素水平的下降,成骨细胞Cyclin D1、CDK4、p21蛋白出现明显高表达,成骨细胞增殖加快,同时,成骨细胞周期受阻滞亦增多,成骨细胞数量仍显相对不足,骨形成低于骨吸收,最终导致骨质疏松的发生。 2健骨颗粒能提高去卵巢骨质疏松模型鼠成骨细胞G1期调节蛋白Cyclin D1、CDK4的表达,抑制负性调节因子p21的表达,促进成骨细胞增殖,这可能是健骨颗粒防治绝经后骨质疏松症的机制之一。 3健骨颗粒能提高体外培养成骨细胞G1期调节蛋白Cvclin D1、CDK4的表达,抑制负性调节因子p21的表达,加快细胞从G1期向S期推进,推动成骨细胞增殖周期进程,从而促进成骨细胞增殖,进一步探讨了健骨颗粒通过调节G1期调节蛋白,促进成骨细胞增殖的机理。


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